310 10 * 1mm Thành phần hóa học ống cuộn bằng thép không gỉ, Miền đầu N của spidroin tạo thành hydrogel dựa trên các sợi amyloid và cung cấp nền tảng cho quá trình cố định protein.

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Ngoài ra, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Thanh trượt hiển thị ba bài viết trên mỗi slide.Sử dụng các nút quay lại và tiếp theo để di chuyển qua các trang chiếu hoặc các nút điều khiển trang chiếu ở cuối để di chuyển qua từng trang chiếu.

Sự chỉ rõ

310 10*1mm Nhà cung cấp ống thép không gỉ cuộn

Thành phần hóa học

Tính chất cơ học

Protein tơ nhện tái tổ hợp (protein tơ nhện) có nhiều ứng dụng tiềm năng trong việc phát triển vật liệu sinh học mới, nhưng tính chất đa phương thức và dễ kết tụ của chúng khiến chúng khó thu được và dễ sử dụng.Ở đây chúng tôi báo cáo rằng các protein spidroin thu nhỏ tái tổ hợp và quan trọng là chính miền N-terminal (NT) nhanh chóng hình thành các hydrogel trong suốt và tự hỗ trợ ở 37 ° C.các protein tổng hợp bao gồm NT và protein huỳnh quang màu xanh lá cây hoặc purine nucleoside phosphorylase tạo thành các protein tổng hợp có đầy đủ chức năng.Hydrogel.Kết quả của chúng tôi cho thấy rằng NT tái tổ hợp và protein tổng hợp mang lại năng suất biểu hiện cao và mang lại cho hydrogel những đặc tính hấp dẫn như độ trong suốt, tạo gel mà không cần liên kết ngang và cố định trực tiếp các protein hoạt động ở mật độ cao.
Nhện có tới bảy bộ tuyến tơ khác nhau, mỗi bộ tạo ra một loại tơ cụ thể.Tất cả bảy loài tơ đều bao gồm các protein tơ nhện (spidroin) dài khoảng 6000 gốc và chứa một vùng lặp lại trung tâm lớn được bao quanh bởi các miền đầu N và C hình cầu (NT và CT)1,2.Loại tơ được nghiên cứu rộng rãi nhất, bóng đèn sơ cấp, được sản xuất bởi tuyến bóng đèn sơ cấp.Trong tuyến này, một lớp tế bào biểu mô đơn tổng hợp protein spidroin và tiết chúng vào lòng tuyến, nơi chúng hiện diện ở dạng hòa tan (doping) ở nồng độ cực cao (30–50% w/v)3,4.Tổ chức và cấu tạo của các protein spidroin bóng chính trong tuyến đã được tranh luận, nhưng hầu hết bằng chứng thực nghiệm cho thấy sự hiện diện của cấu trúc xoắn ốc nói chung và/hoặc cấu trúc xoắn ốc ngẫu nhiên và các cấu trúc mixen hoặc lamellar5,6,7,8,9,10.Trong khi các miền lặp lại điều chỉnh các tính chất cơ học của sợi tơ, hình thành các tinh thể nano tấm β và các cấu trúc vô định hình11,12,13,14,15, thì các miền cuối điều chỉnh các sợi tơ để đáp ứng với các điều kiện thay đổi dọc theo tuyến tơ16,17,18.Bằng cách kiểm soát sự hình thành tơ, 19. Các miền đầu cuối được bảo tồn về mặt tiến hóa và chức năng của chúng có thể phổ biến đối với tất cả các protein spidroin 2,20,21.Trong quá trình đi qua tuyến, độ pH của spidroin giảm từ khoảng 7,6 đến < 5,716 và tăng lên khi bị cắt và kéo căng qua trung gian di chuyển qua ống dẫn hẹp dần.Trong dung dịch, CT là một dimer song song cấu thành xoắn ốc17, nhưng để đáp ứng với độ pH và lực cắt thấp, CT mở ra và chuyển đổi các lớp β16, 17, có thể kích hoạt các lớp β trong các vùng lặp lại của Convert 16. NT là đơn phân theo các điều kiện phản ánh các điều kiện trong lòng tuyến và làm trung gian cho khả năng hòa tan của spidroin, nhưng ở độ pH giảm, sự proton hóa của một số chuỗi bên axit cacboxylic dẫn đến sự dimer hóa NT với pKa xấp xỉ 6,5, do đó ổn định NT và cố định spidroin ở mức độ lớn. số lượng.mạng16,18.Do đó, NT đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành sợi, thay đổi từ monome trong lớp phủ thành dimer trong sợi23,24,25.NT vẫn có khả năng hòa tan cao và xoắn ốc trong mọi điều kiện được nghiên cứu cho đến nay16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, điều này đã truyền cảm hứng cho sự phát triển của nó như một nhãn tăng cường khả năng hòa tan để sản xuất protein dị loại.
Protein tơ nhện mini tái tổ hợp, bao gồm một NT, một vùng lặp lại ngắn, một CT và thẻ His6 (His-NT2RepCT) để tinh chế, hòa tan trong dung dịch đệm như protein tơ nhện tự nhiên và mô phỏng các đặc tính quan trọng tự nhiên của nhện tơ .bảo hiểm 25.31.His-NT2RepCT có thể được kéo thành sợi liên tục bằng máy mô phỏng sinh học trong đó lớp phủ hòa tan có độ pH 8 được ép vào bể nước có độ pH 525,32,33,34,35.Quá trình lên men phản ứng sinh học của E. coli biểu hiện His-NT2RepCT và quá trình xử lý sau đó mang lại hiệu suất >14 g/L sau khi tinh chế.Năng suất cao, độ hòa tan cao và phản ứng thích hợp của His-NT2RepCT với điều kiện axit đều là do NT23, 25, 34.
Ở đây chúng tôi báo cáo sự hình thành nhanh chóng của hydrogel trong suốt từ protein spidroin tái tổ hợp, bao gồm cả NT, bằng cách ủ dung dịch protein ở 37 ° C.Sử dụng huỳnh quang thioflavin T (ThT), quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR), quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM), chúng tôi thấy rằng protein NT và microspider trải qua quá trình biến đổi cấu trúc thành các tấm β và sợi giống amyloid khi gel được hình thành.Ngoài ra, protein tổng hợp của NT và protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) hoặc purine nucleoside phosphorylase (PNP) tạo thành hydrogel với các mảnh hợp nhất đầy đủ chức năng.Biểu hiện thông lượng cao ở vật chủ dị loại, cùng với sự hình thành hydrogel nhanh chóng trong điều kiện sinh lý, mở ra khả năng sản xuất hydrogel hiệu quả về mặt chi phí với các chức năng được thiết kế.
Không giống như hầu hết các protein spidroin tái tổ hợp được báo cáo36, His-NT2RepCT ổn định trong đệm Tris-HCl ở pH 8 và có thể cô đặc tới 500 mg/mL mà không kết tủa25.Do đó, chúng tôi rất ngạc nhiên khi thấy rằng protein này nhanh chóng hình thành hydrogel tự hỗ trợ, trong suốt về mặt quang học khi được ủ ở 37°C (Hình 1b-d).Các nghiên cứu sâu hơn cho thấy quá trình tạo gel His-NT2RepCT xảy ra trên một phạm vi nồng độ protein rộng (10–300 mg/mL) và nồng độ này tương quan nghịch với thời gian tạo gel (Hình 1c và Hình bổ sung. 1).Để tìm ra phần nào của sự hình thành hydrogel trung gian His-NT2RepCT, sau đó chúng tôi đã kiểm tra từng miền riêng lẻ và trong các kết hợp khác nhau bằng cách sử dụng xét nghiệm đảo ngược bình (Hình 1a, b).Tất cả các phân đoạn được thử nghiệm của gel hình thành spidroin tái tổ hợp (ở nồng độ protein 300 mg/mL) trong vòng chưa đầy 1 giờ, ngoại trừ 2Rep kết tủa (Hình 1b).Điều này cho thấy rằng chỉ riêng NT và CT, kết hợp hoặc liên kết với các lần lặp lại, có thể tạo gel ở 37°C và thẻ His6 không ảnh hưởng đến quá trình này ở bất kỳ mức độ đáng kể nào.Với quan niệm chung rằng NT là một loại protein có độ hòa tan cao và ổn định, và các báo cáo trước đây về hydrogel spidroin tái tổ hợp đã cho rằng hiệu ứng tạo gel là do những thay đổi về hình dạng ở các vùng lặp lại và / hoặc CT, bản thân NT cũng có thể.Việc phát hiện ra chất gel hóa thật bất ngờ.Bảng bổ sung 1) 37, 38, 39. Đáng chú ý, NT đã đông cứng trong vòng 10 phút ở nồng độ ≥ 300 mg/mL (Hình 1c).Các thí nghiệm đảo ngược lọ với các nồng độ NT khác nhau cho thấy rằng ở mức >50 mg/mL dung dịch NT tạo gel nhanh hơn His-NT2RepCT ở nồng độ tương ứng (w/v, Hình 1c).
Sơ đồ biểu diễn các cấu trúc spidroin khác nhau được nghiên cứu trong nghiên cứu này.b Thời gian tạo gel ở 37°C đối với các protein spidroin tái tổ hợp khác nhau (300 mg/mL) được xác minh bằng cách đảo ngược lọ.CT gel ngay lập tức mà không cần ủ (<300 mg/mL), kết tủa 2Rep (300 mg/mL, thang đo 5 mm).c Thời gian tạo gel của His-NT2RepCT và NT ở nồng độ protein được chỉ định ở 37°C.d Ảnh chụp các hydrogel His-NT2RepCT và NT với hình con nhện và chữ “NT” được in bên dưới tương ứng (cả hai đều 200 mg/mL, thanh tỷ lệ 5 mm).
Hydrogel được hình thành bởi các protein spidroin tái tổ hợp khác nhau có màu sắc hơi khác nhau và quan sát bằng mắt thường cho thấy mức độ trong suốt khác nhau (Hình 1b).Gel NT đặc biệt trong suốt trong khi các loại gel khác trở nên mờ đục.Gel His-NT2RepCT và NT được đúc thành ống hình trụ có thể được lấy ra khỏi khuôn một cách nguyên vẹn (Hình 1d).
Để kiểm tra xem liệu gel phủ tơ nhện tự nhiên trong các điều kiện hiện nay có gây ra sự tạo gel của protein spidroin tái tổ hợp hay không, lớp phủ được thu thập từ tuyến bóng lớn của nhện cầu Thụy Điển (Larinioides sclopetarius).Các lớp phủ được bảo quản trong dung dịch đệm Tris-HCl 20 mM ở nồng độ 50 mg/mL (dựa trên trọng lượng khô đo được), nhưng không quan sát thấy hiện tượng gel hóa trong 21 ngày ủ ở 37 ° C (Hình bổ sung 2a).
Để định lượng các gel này, các phép đo lưu biến có thể được sử dụng để nghiên cứu quá trình tạo gel và xác định các tính chất cơ học tổng thể.Đặc biệt, việc theo dõi mô đun lưu trữ (độ đàn hồi) ở nhiệt độ cao có thể cung cấp thông tin về nhiệt độ tạo gel cũng như đặc tính đàn hồi nhớt của lớp phủ.Các thí nghiệm tăng nhiệt độ (sử dụng 1°C/phút ở 25-45°C, dựa trên các nghiên cứu trước đây sử dụng dung dịch gốc tơ tự nhiên)40,41 cho thấy mô đun lưu trữ của dung dịch His-NT2RepCT và NT tăng khi nhiệt độ tăng.đã tăng lên (Hình 2 và Hình bổ sung 3).Đáng chú ý, mô-đun NT bắt đầu phát triển ở nhiệt độ thấp hơn so với His-NT2RepCT, phù hợp với thời gian tạo gel nhanh hơn được quan sát thấy khi NT được ủ trực tiếp với His-NT2RepCT ở 37°C (Hình 1).Sau lần giảm nhiệt độ tiếp theo, mô đun lưu trữ không trở về giá trị thấp hơn và vẫn ở trên mô đun tổn thất (xem Hình bổ sung 3), cho thấy quá trình tạo gel ổn định không thể đảo ngược về mặt nhiệt.Sau khi tạo gel, mô đun đàn hồi cuối cùng dao động từ 15 đến 330 kPa đối với hydrogel His-NT2RepCT ở nồng độ 100–500 mg/mL và mô đun đàn hồi cuối cùng cho hydrogel NT (100–500 mg/mL) dao động từ 2 đến 1400 kPa (Hình 2 và dữ liệu đoạn đường nối đầy đủ) xem Hình bổ sung 3).
a Thay đổi nhiệt độ trong quá trình đo His-NT2RepCT (300 mg/mL) và b NT (300 mg/mL) khi lắc.Các mũi tên biểu thị xu hướng nhiệt độ và màu sáng hơn của dữ liệu mô-đun lưu trữ mô tả việc thử nghiệm ở các giá trị mô-men xoắn cho thiết bị thấp hơn so với chỉ định của nhà sản xuất, đây là nguyên nhân gây ra tiếng ồn tăng lên.c Tích lũy mô-đun cuối của His-NT2RepCT và NT sau khi nhiệt độ tăng cao (100, 300 và 500 mg/mL).Tất cả các bài đọc mô-đun được lấy ở tần số 0,1 Hz.
Là một phương pháp tiềm năng để nghiên cứu những thay đổi về hình dạng liên quan đến quá trình tạo gel, chúng tôi đã ghi lại phổ FTIR của His-NT2RepCT và NT trước và sau khi tạo gel ở 37°C (Hình 3a, b).Đúng như dự đoán, quang phổ của dung dịch His-NT2RepCT và NT tương ứng với các protein có cấu trúc bậc hai xoắn ốc/cuộn ngẫu nhiên, với dải rõ rệt ở 1645 cm-1.Đối với cả hai hydrogel, quá trình tạo gel dẫn đến sự hình thành hai nhánh ở dải I ở giữa ở khoảng 1617 cm-1 và 1695 cm-1 (Hình 3a, b), cho thấy sự hình thành các cấu trúc tấm β phản song song.Những thay đổi này cũng có thể được nhìn thấy rõ ràng trong quang phổ tạo gel khác biệt và đạo hàm thứ hai tương ứng (Hình bổ sung 4b).Hai dải của lớp β NT rõ rệt hơn so với các dải của His-NT2RepCT, cho thấy tổng hàm lượng của các dải β trong hydrogel NT cao hơn so với hydrogel NT2RepCT.
phổ hấp thụ FTIR của His-NT2RepCT và b NT (cả 500 mg/mL) trước (dung dịch) và sau khi ủ (gel) ở 37°C.c Ảnh TEM của gel NT2RepCT 50 mg/ml được treo lại và d NT.Thanh tỷ lệ 200 nm.e Đường kính sợi của hydrogel His-NT2RepCT và NT.n = 100 sợi đo được, p < 0,0001.Các thanh lỗi hiển thị độ lệch chuẩn.Trung tâm của các thanh lỗi là giá trị trung bình.Một bài kiểm tra t không ghép đôi (hai đuôi) đã được sử dụng để phân tích thống kê.f ThT huỳnh quang của các protein spidroin tái tổ hợp khác nhau (100 mg/mL) ở 37 ° C mà không lắc.g NT (100 mg/mL) thí nghiệm cấy từ gel NT 100 mg/mL với 0%, 5%, 10% và 20% hạt.
Phân tích gel bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy hydrogel bao gồm các sợi nhỏ giống amyloid (Hình 3c, 3d).Các sợi cơ hình thành NT được kéo dài (đường kính 5–12nm) và không phân nhánh, trong khi các sợi cơ His-NT2RepCT có chiều dài ngắn hơn và đường kính rộng hơn đáng kể (7–16nm) (Hình 3e).Những kết quả này cho phép chúng tôi theo dõi động học của quá trình xơ hóa bằng xét nghiệm thioflavin T (ThT).Đối với tất cả các protein spidroin tái tổ hợp, tín hiệu huỳnh quang tăng lên khi các mẫu được ủ ở 37 ° C (Hình 3f, Hình bổ sung 5a).Phù hợp với phát hiện này, việc kiểm tra bằng kính hiển vi NT và His-NT2RepCT trong điều kiện tạo gel cho thấy sự gia tăng đồng đều huỳnh quang ThT mà không có sự tích lũy cục bộ đáng chú ý của các tập hợp ThT dương tính (Hình bổ sung 5b, c).Sự hình thành các sợi cơ dương tính với ThT không đi kèm với sự gia tăng độ đục của NT và His-NTCT (Hình bổ sung 5d), có nghĩa là mạng lưới các sợi cơ trong gel có thể hình thành mà không ảnh hưởng đến độ trong của gel.Việc gieo hạt bằng cách thêm một lượng nhỏ các sợi fibril được hình thành trước có thể đẩy nhanh đáng kể sự hình thành sợi fibril của một số amyloid42,43,44 nhưng thêm 5%, 10% hoặc 20% (w/w) NT vào dung dịch chất keo tụ hydro NT.hiệu ứng gieo hạt (Hình 3g).Có lẽ điều này là do các sợi nhỏ trong hydrogel tương đối cố định và không thể sử dụng làm hạt giống.
Hoạt động bất ngờ của protein spidroin tái tổ hợp ở nhiệt độ cao đã thúc đẩy các nghiên cứu quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) tiếp theo để xác định những thay đổi về hình dạng liên quan đến sự hình thành gel.Phổ NMR của dung dịch His-NT2RepCT được ghi lại theo thời gian ở 37°C cho thấy CT vẫn bị gấp một phần, trong khi tín hiệu NT và 2Rep đã biến mất (Hình 4a), cho thấy rằng chủ yếu là NT và 2Rep kiểm soát một phần sự hình thành His- Hydrogel NT2RepCT.Tín hiệu CT cũng bị suy giảm đến 20% cường độ ban đầu, cho thấy CT cũng hầu như được cố định và tích hợp vào cấu trúc hydrogel.Đối với một phần nhỏ hơn của CT, có tính di động như trong mẫu đã được ủ trước và do đó được quan sát bằng dung dịch NMR, quang phổ thiếu tín hiệu cho 10 gốc có cấu trúc đầu tiên, có thể do khó cố định phần đính kèm của His-NT2Rep.Phổ NMR ở trạng thái của hydrogel -NT2RepCT cho thấy sự hiện diện chủ yếu của các chuỗi xoắn ốc và lớp β và ở mức độ thấp hơn là cấu trúc cuộn dây ngẫu nhiên (Hình 4b).Phân tích dịch chuyển hóa học của dư lượng methionine chỉ có ở NT cho thấy miền này đã được chuyển đổi sang cấu trúc tấm β.Phổ phụ thuộc thời gian của NT trong dung dịch cho thấy cường độ tín hiệu giảm đồng đều (Hình 4c) và NMR trạng thái rắn của hydrogel NT cho thấy hầu hết dư lượng NT đã được chuyển đổi thành cấu trúc tấm β (Hình 4d).Cấu hình của 2Rep không thể được xác định riêng biệt do xu hướng tổng hợp của nó.Tuy nhiên, phổ NMR ở trạng thái rắn của hydrogel NTCT và His-NT2RepCT trông rất giống nhau (Hình 4b; Hình bổ sung 6b), cho thấy rằng 2Rep đóng góp rất ít vào phần cấu trúc của hydrogel His-NT2RepCT.Đối với hydrogel CT, các chuỗi xoắn ốc α, tấm β và các cấu trúc thứ cấp xoắn ốc ngẫu nhiên đã được tìm thấy tồn tại (Hình bổ sung 6d).Điều này gợi ý rằng một số phần của CT vẫn giữ nguyên dạng xoắn α trong khi những phần khác trở thành tấm β.Do đó, kết quả quang phổ NMR cho thấy NT rất quan trọng đối với sự hình thành hydrogel và cũng biến đổi thành cấu trúc tấm β khi hợp nhất với 2Rep và CT.Phù hợp với điều này, gần đây chúng tôi đã phát hiện ra rằng các dây kéo không gian amyloid có khả năng hình thành trong cả năm vòng xoắn của miền NT và thuật toán Waltz đã dự đoán vùng tạo amyloid trong chuỗi xoắn 1 (Hình 4e).
Phổ 2D của dung dịch 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT trước (màu xanh) và 19 giờ sau khi ủ (màu đỏ) ở 37°C.Các đỉnh chéo riêng lẻ trong phổ màu đỏ và F24, G136, polyA trong phổ màu xanh lam được biểu thị bằng ký hiệu axit amin một chữ cái và số dư lượng.Các phần bên trong cho thấy sự phụ thuộc của cường độ tín hiệu vào thời gian đối với các dư lượng được chọn từ các miền NT, 2Rep và CT.b Phổ tần số vô tuyến trạng thái rắn (RFDR) của hydrogel His-NT2RepCT.Mối tương quan của dư lượng Cα/Cβ quan sát được trong phổ RFDR được xác định bằng cách so sánh với các dịch chuyển hóa học peptide mô hình và các giá trị thu được từ số liệu thống kê82,83 và các cấu trúc thứ cấp của chúng.SSB – dải biên xoay.c Phổ một chiều của dung dịch NT 15N-HSQC 10 mg/mL trong quá trình ủ ở 37 ° C trong 36 giờ.Hình nhỏ cho thấy cường độ thể tích theo thời gian.d Phổ RFDR trạng thái rắn của hydrogel NT.Mối tương quan của dư lượng Cα/Cβ và cấu trúc thứ cấp của chúng quan sát được trong phổ RFDR được chỉ ra.e Dựa trên hồ sơ xu hướng rung tâm NT45.79 từ cơ sở dữ liệu Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Năng lượng Rosetta của cửa sổ dịch chuyển sét không gian của hexapeptide được biểu thị bằng kcal/mol.Thanh màu đỏ biểu thị hexapeptide có xu hướng xơ hóa cao (năng lượng Rosetta dưới -23 kcal/mol; bên dưới đường chấm).Thanh màu xanh biểu thị các mảnh có năng lượng Rosetta trên ngưỡng và do đó ít có khả năng hình thành các dây kéo không gian.Các mảnh chứa proline đã bị loại khỏi phân tích (không có cột).Các hình vuông biểu thị các khu vực mắc bệnh amyloidosis được thuật toán Waltz dự đoán81 (//waltz.switchlab.org).Trình tự các dư lượng axit amin của NT nằm ở trên cùng và các loại dư lượng được tìm thấy trong cấu trúc bậc hai β (được xác định bằng phương pháp quang phổ NMR trạng thái rắn) được hiển thị bằng màu đỏ.Vị trí của năm chuỗi xoắn ốc NT được chỉ định là (H1-H5)28.
Ở độ pH <6,5, HT dimer hóa, có khả năng chống lại sự biến tính do nhiệt hoặc urê gây ra18.Để làm sáng tỏ sự ảnh hưởng của quá trình dime hóa và độ ổn định của NT đến quá trình tạo gel, các dung dịch chứa 100 mg/ml NT được kiểm soát ở pH 8, 7 và 6 bằng thử nghiệm đảo ngược lọ.Các mẫu NT được ủ ở pH 8 và 7 gel hóa sau 30 phút ở 37 ° C, nhưng gel pH 8 vẫn trong, trong khi gel pH 7 cho thấy kết tủa nhìn thấy được (Hình 5a).Ngược lại, dung dịch chứa HT ở pH 6 không tạo thành gel và có thể thấy kết tủa lớn sau 20 phút ở 37°C.Điều này cho thấy rằng bản thân các chất điều chỉnh độ sáng và/hoặc độ ổn định cao hơn của chúng so với các đơn phân ngăn ngừa sự tạo gel.Sự hình thành kết tủa cho NT ở pH 7 và 6 là không được mong đợi, vì đã có báo cáo rằng NT hòa tan ở mức 200 mg/ml27, dễ dàng gấp lại sau khi biến tính nhiệt và cũng giữ lại chuỗi xoắn α ở các giá trị thấp hơn Độ pH 18. Lời giải thích có thể xảy ra cho những khác biệt này là các thí nghiệm được báo cáo trước đây được thực hiện ở nhiệt độ phòng hoặc thấp hơn hoặc ở nồng độ protein tương đối thấp16,18,19.
Thử nghiệm đảo ngược lọ NT (100 mg/mL) ở pH 8, 7, 6 và 154 mM NaCl (pH 8) sau khi ủ ở 37°C.b Phổ NT CD có và không có 154 mM NaF và 154 mM NaCl tương ứng.Độ elip mol ở bước sóng 222 nm được chuyển đổi thành tỷ lệ các nếp gấp tự nhiên.c Xét nghiệm đảo ngược NT (100 mg/mL) NT* (37 °C và 60 °C), NTA72R (37 °C) và His-NT-L6 (37 °C và 60 °C).d Phổ CD của các đột biến NT NT*, NTA72R và His-NT-L6.Độ elip mol ở bước sóng 222 nm được chuyển đổi thành tỷ lệ các nếp gấp tự nhiên.e Xét nghiệm đảo ngược NTFlSp, NTMiSp và NTMiSp giảm (100 mg/mL).Thanh tỷ lệ 5 mm.f Phổ CD của NT, NTFlSp, NTMiSp và NTMiSp khử.Độ elip mol ở bước sóng 222 nm được chuyển đổi thành tỷ lệ các nếp gấp tự nhiên.Phổ NT đầy đủ ở 25 ° C và 95 ° C được thể hiện trong Hình 8 bổ sung.
Nồng độ muối sinh lý xác định tương tác tĩnh điện giữa các tiểu đơn vị NT và quá trình dimer hóa quá trình chuyển NT xuống mức pH18 thấp hơn.Chúng tôi thấy rằng sự hiện diện của 154 mM NaCl và NaF thực sự đã ức chế quá trình tạo gel tương ứng (Hình 5a, b; Hình bổ sung 2b) và các muối này làm tăng độ ổn định nhiệt của các đơn phân NT (Hình 5b, Hình bổ sung 8) .Nó cũng gợi ý rằng việc tăng cường độ ổn định, thay vì giảm thiểu, ngăn ngừa sự hình thành gel.
Để khám phá sâu hơn về vai trò của quá trình giảm thiểu protein và tính ổn định trong quá trình tạo gel, chúng tôi đã sử dụng hai đột biến NT* và NTA72R, những đột biến này cũng vẫn duy trì dạng đơn phân ở độ pH thấp28,30.NT* là chất đột biến đảo ngược điện tích kép trong đó sự phân bố điện tích lưỡng cực biểu kiến ​​của monome bị làm phẳng, giúp ngăn cản quá trình dimer hóa và tăng mạnh độ ổn định của monome.NTA72R là một lưỡng cực tích điện, nhưng Ala được thay thế bằng Arg nằm ở ranh giới mờ hơn, do đó các đột biến cản trở các tương tác tiểu đơn vị cần thiết cho quá trình thu nhỏ lại.Khi ủ ở 37°C, NT* không tạo thành hydrogel, trong khi NTA72R tạo thành gel mờ trong 15 phút (Hình 5c).Vì cả NT * và NTA72R đều không thể thu nhỏ lại nhưng khác nhau về độ ổn định monome (Hình 5d), những kết quả này cho thấy rõ ràng rằng độ ổn định nhiệt động cao sẽ ngăn cản NT tạo gel.Điều này cũng được hỗ trợ bởi thực tế là HT* tạo thành gel khi nó không ổn định ở nhiệt độ cao (sau 8 phút ở 60°C; Hình 5c).Trước đây người ta đã chứng minh rằng hàm lượng methionine cao trong NT hóa lỏng nếp gấp tự nhiên của nó và sáu chất thay thế Met thành Leu (ở đây gọi là His-NT-L6) ổn định mạnh mẽ monome NT46.Dựa trên giả định rằng cần có sự linh hoạt về cấu trúc để hình thành gel NT, chúng tôi thấy rằng đột biến ổn định His-NT-L6 không tạo gel ở 37 ° C (Hình 5c, d).Tuy nhiên, His-NT-L6 cũng tạo thành gel khi ủ ở 60°С trong 60 phút (Hình 5c).
Khả năng NT biến đổi thành cấu trúc tấm β và tạo thành hydrogel dường như áp dụng cho một số nhưng không phải tất cả các miền NT của spidroin.NT từ các loại tơ và loài nhện khác nhau, Trichonophila clavipes (NTFlSp), tạo thành gel mặc dù hàm lượng methionine tương đối thấp và độ ổn định nhiệt cao (Hình 5e, f và Bảng bổ sung 2).Ngược lại, NT từ spidroin protein dạng ống nhỏ từ Araneus ventricosus (NTMiSp) có độ ổn định nhiệt thấp và hàm lượng methionine cao không tạo thành hydrogel (Bảng bổ sung 2 và Hình 5e, f).Loại thứ hai có thể liên quan đến sự hiện diện của các liên kết disulphide nội phân tử29,47.Một cách nhất quán, khi các liên kết disulfide của NTMiSp bị giảm, nó sẽ tạo thành hydrogel sau khi ủ ở 37°C trong 10 phút (Hình 5e).Tóm lại, cần lưu ý rằng tính linh hoạt của cấu trúc là một tiêu chí quan trọng nhưng không phải là tiêu chí duy nhất để hình thành gel từ NT.Một yếu tố khác có thể liên quan là xu hướng hình thành các sợi amyloid và phân tích bằng cơ sở dữ liệu dây kéo và thuật toán Waltz đã cho thấy mối tương quan giữa khả năng hình thành gel và sự hiện diện của các vùng tạo amyloid, cũng như phạm vi của các vùng được dự đoán. để tạo thành dây kéo không gian.Có một mối tương quan (Bảng bổ sung 2 và Hình bổ sung 9).
Khả năng NT hình thành các sợi nhỏ và tạo gel trong điều kiện thuận lợi khiến chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng sự kết hợp NT với các đoạn protein khác vẫn có thể tạo thành gel với đầy đủ chức năng của các đối tác hợp nhất.Để kiểm tra điều này, chúng tôi đã giới thiệu protein huỳnh quang màu xanh lá cây (GFP) và purine nucleoside phosphorylase (PNP) tại đầu C của NT, tương ứng.Các protein tổng hợp thu được được biểu hiện ở E. coli với hiệu suất cuối cùng rất cao (tương ứng là nuôi cấy trong bình lắc 150 mg/L và 256 mg/L đối với His-NT-GFP và His-NT-PNP), phù hợp với những gì đã được chứng minh. cho các protein khác được hợp nhất với NT Ref.30. Protein tổng hợp His-NT-GFP (300mg/mL) và His-NT-PNP (100mg/mL) hình thành gel sau 2 giờ và 6,5 giờ ở 37°C và quan trọng là tỷ lệ GFP không thay đổi.quan sát thấy sau khi tạo gel, với > 70% cường độ huỳnh quang ban đầu còn lại sau quá trình tạo gel (Hình 6a).Để đo hoạt tính PNP trong dung dịch và gel-NT-PNP của anh ấy, chúng tôi phải pha loãng protein tổng hợp với NT vì hoạt tính enzyme của chế phẩm nguyên chất nằm ngoài phạm vi phát hiện của xét nghiệm ở nồng độ tạo gel.Gel được hình thành bằng hỗn hợp chứa 0,01 mg/mL His-NT-PNP và 100 mg/mL NT giữ lại 65% hoạt tính enzyme ban đầu của các mẫu đã ủ trước (Hình 6b).Gel vẫn còn nguyên trong quá trình đo (Hình bổ sung 10).
cường độ huỳnh quang tương đối trước và sau khi tạo gel His-NT-GFP (300 mg / mL) và lọ đảo ngược chứa His-NT-GFP hydrogel (300 mg / mL) dưới ánh sáng nhìn thấy và tia cực tím.Điểm hiển thị số đo riêng lẻ (n = 3), thanh lỗi hiển thị độ lệch chuẩn.Giá trị trung bình được hiển thị ở giữa thanh lỗi.b Hoạt tính PNP thu được bằng phân tích huỳnh quang sử dụng dung dịch và gel bao gồm NT (100 mg/ml) và hỗn hợp chứa 0,01 mg/ml his-NT-PNP và 100 mg/ml Đô la Đài Loan mới.Hình nhỏ cho thấy một lọ đảo ngược chứa hydrogel chứa His-NT-PNP (thanh tỷ lệ 5 mm).
Ở đây, chúng tôi báo cáo sự hình thành hydrogel từ NT và các protein spidroin tái tổ hợp khác bằng cách ủ dung dịch protein ở 37°C (Hình 1).Chúng tôi chứng minh rằng quá trình tạo gel có liên quan đến sự biến đổi các chuỗi xoắn ốc thành các lớp β và sự hình thành các sợi cơ giống amyloid (Hình 3 và 4).Phát hiện này thật đáng ngạc nhiên vì NT là các bó 5 chuỗi xoắn hình cầu cuộn được biết đến với độ hòa tan cực cao và độ ổn định cao ở nồng độ > 200 mg/mL ở 4°C trong vài ngày27.Ngoài ra, NT dễ dàng gấp lại sau khi biến tính nhiệt ở nồng độ protein thấp tính bằng µM.Theo kết quả của chúng tôi, sự hình thành fibril đòi hỏi sự kết hợp giữa nồng độ protein> 10 mg/mL và nhiệt độ tăng nhẹ (Hình 1).Điều này phù hợp với ý tưởng rằng các sợi amyloid có thể hình thành từ các protein gấp hình cầu ở trạng thái mở ra một phần do biến động nhiệt trong điều kiện sinh lý48 .Ví dụ về các protein trải qua quá trình chuyển đổi này bao gồm insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin và lysozyme51,52,53.Mặc dù NT là chuỗi xoắn ốc ở trạng thái tự nhiên, nhưng khoảng 65% chuỗi polypeptide tương thích với sự hình thành dây kéo không gian (Hình 4e) 45 .Vì monome có tính di động linh hoạt46, nên nó có thể bộc lộ các vùng tạo amyloid tiềm năng này ở nhiệt độ cao vừa phải và ở nồng độ cao của protein tổng số có thể đạt đến nồng độ tới hạn để hình thành sợi amyloid54.Theo lý do này, chúng tôi đã tìm thấy mối tương quan nghịch giữa nồng độ spidroin và thời gian tạo gel (Hình 1c) và nếu cấu trúc NT đơn phân được ổn định bằng đột biến (NT*, His-NT-L6) hoặc bằng cách thêm muối, có thể ngăn chặn sự hydrogel hình thành (Hình 5).
Trong hầu hết các trường hợp, các sợi amyloid biến mất khỏi dung dịch dưới dạng kết tủa, nhưng trong một số điều kiện nhất định, chúng có thể tạo thành hydrogel55,56,57.Các sợi nhỏ hình thành hydrogel thường có tỷ lệ khung hình cao và hình thành mạng ba chiều ổn định thông qua sự vướng víu phân tử,55,58 phù hợp với kết quả của chúng tôi.Để hình thành hydrogel trong ống nghiệm, protein thường được mở ra hoàn toàn hoặc một phần, ví dụ, khi tiếp xúc với dung môi hữu cơ, nhiệt độ cao (70–90°C) và/hoặc độ pH thấp (1,5–3,0)59,60,61,62.Hydrogel spidroin được mô tả ở đây không yêu cầu xử lý khắc nghiệt cũng như không yêu cầu các tác nhân liên kết ngang để ổn định hydrogel.
Trước đây đã có báo cáo rằng spidroin lặp lại và các QD, dường như trải qua quá trình chuyển đổi tờ in trong quá trình kéo sợi tơ, tạo thành hydrogel.So với những phát hiện của chúng tôi, thời gian ủ và/hoặc nhiệt độ ủ tương ứng dài hơn hoặc cao hơn đáng kể và hydrogel thu được thường mờ đục (Hình 7 và Bảng bổ sung 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Ngoài thời gian tạo gel nhanh, hydrogel NT >300 mg/mL (30%) vượt trội hơn tất cả các hydrogel protein tơ nhện tái tổ hợp được mô tả khác, cũng như hydrogel tự nhiên như gelatin, alginate (2%), agar (0,5 %). ) và collagen.(0,6%) (Hình 7 và Bảng bổ sung 1 và 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Thời gian tạo gel và mô đun đàn hồi của hydrogel trong nghiên cứu này được so sánh với các hydrogel dựa trên spidroin khác và hydrogel tự nhiên được chọn lọc.Các tài liệu tham khảo được đưa ra cùng với mô tả về các điều kiện tạo gel.APS Amoni Persulfate, nhiệt độ phòng.Dữ liệu 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Nhện dường như đã phát triển các cách để ngăn chặn spidroin đông lại trong quá trình bảo quản.Mặc dù nồng độ protein cao trong tuyến tơ, vùng lặp lại lớn liên quan đến miền cuối có nghĩa là nồng độ rõ ràng của NT và CT trong tuyến tương ứng với khoảng 10-20 mg/ml, tại ranh giới của nghiên cứu này.cần thiết cho sự hình thành hydrogel quan sát được trong ống nghiệm.Ngoài ra, nồng độ muối tương tự 16 đã ổn định NT, như trong các tuyến tơ (Hình 5b).Cấu trúc NT đã được nghiên cứu trong bào tương của E. coli và được phát hiện là có nếp gấp chặt hơn so với khi kiểm tra in vitro, điều này cho thấy thêm rằng muối hoặc các yếu tố khác ngăn cản sự kết tụ của nó trong cơ thể.Tuy nhiên, khả năng NT biến đổi thành các sợi fibrils tấm β có thể rất quan trọng đối với sự hình thành sợi và cần được nghiên cứu trong các nghiên cứu trong tương lai.
Ngoài các khía cạnh mới của sự hình thành fibril và hydrogel giống NT-amyloid được quan sát trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng chỉ ra rằng hiện tượng này có thể có các ứng dụng công nghệ sinh học và y sinh (Hình 8).Để chứng minh khái niệm, chúng tôi đã kết hợp NT với GFP hoặc PNP và chỉ ra rằng protein tổng hợp cũng tạo thành hydrogel khi được ủ ở 37°C và các phần GFP và PNP phần lớn vẫn duy trì hoạt động của chúng sau khi tạo gel (Hình 6).Nucleoside phosphorylase là chất xúc tác quan trọng tổng hợp các chất tương tự nucleoside75, điều này làm cho phát hiện của chúng tôi có liên quan đến ngành công nghiệp dược phẩm sinh học.Khái niệm biểu hiện protein tổng hợp tạo thành hydrogel trong suốt trong điều kiện thuận lợi cho phép tạo ra hydrogel chức năng với các đặc tính thuận lợi cho nhiều ứng dụng như cố định enzyme, giải phóng thuốc có kiểm soát và kỹ thuật mô.Ngoài ra, NT và NT* là các dấu hiệu biểu hiện hiệu quả30, có nghĩa là NT và các biến thể của nó có thể được sử dụng để sản xuất protein tổng hợp hòa tan với hiệu suất cao và sau đó tạo ra protein mục tiêu cố định trong hydrogel 3D.
NT hòa tan, xoắn ốc và ổn định ở nồng độ thấp (µM) và 37°C.Ở cùng nhiệt độ, nhưng với nồng độ tăng dần (>10 mg/ml), NT tạo thành gel bao gồm các sợi nhỏ giống amyloid.Các protein tổng hợp NT cũng tạo thành gel fibrillar với các mảnh hợp nhất có đầy đủ chức năng, cho phép cố định nhiều loại protein khác nhau trong hydrogel 3D bằng NT.Dưới cùng: NT (PDB: 4FBS) và các minh họa về mạng sợi và cấu trúc protein liên quan (giả định và không vẽ theo tỷ lệ, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Các cấu trúc (xem Bảng bổ sung 4 để biết danh sách đầy đủ bao gồm các trình tự axit amin) được tách dòng vào plasmid pT7 và biến nạp thành E. coli BL21 (DE3).E. coli chứa plasmid được thiết kế được cấy vào môi trường canh thang Luria bổ sung kanamycin (70 mg/l) và nuôi cấy qua đêm ở 30°C và 250 vòng/phút.Sau đó cấy 1/100 vào môi trường LB chứa kanamycin và nuôi cấy ở 30°C và 110 vòng/phút cho đến khi OD600 đạt 0,8.Đối với các nghiên cứu NMR, vi khuẩn được nuôi cấy trong môi trường tối thiểu M9 chứa 2 g D-glucose 13C (Aldrich) và 1 g amoni clorua 15N (Phòng thí nghiệm đồng vị Cambridge, Inc.) để dán nhãn protein bằng đồng vị.Hạ nhiệt độ xuống 20 độ C và tạo ra biểu hiện protein bằng 0,15 mM isopropylthiogalactopyranoside (nồng độ cuối cùng).Sau khi biểu hiện protein qua đêm, tế bào được thu hoạch ở nhiệt độ 7278×g, 4°C trong 20 phút.Các viên tế bào được treo lại trong 20 mM Tris-HCl, pH 8 và đông lạnh cho đến khi sử dụng tiếp.Các tế bào đã tan băng được ly giải bằng cách sử dụng máy phá vỡ tế bào (máy dòng TS, Constant Systems Limited, Anh) ở mức 30 kPa.Sau đó lysate được ly tâm ở 25.000 g trong 30 phút ở 4°C.Đối với NTMiSp, viên này sau đó được huyền phù lại trong urê 2 M, 20 mM Tris-HCl, pH 8 và được siêu âm trong 2 phút (bật/tắt 2 giây, 65%), sau đó ly tâm lại ở 25.000 xg, 4° C. trong khoảng 30 phút.Chất nổi phía trên được nạp vào cột Ni-NTA, rửa bằng 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, và cuối cùng protein được rửa giải bằng 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Để tạo ra NT2RepCT và NTCT, tiêu hóa trombin giới thiệu vị trí (ThrCleav) giữa His và NT.Các vị trí phân cắt Thrombin cũng có mặt trong His-NT-ThrCleav-2Rep (sản xuất 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (sản xuất NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (sản xuất CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (sản xuất NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (sản xuất NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (sản xuất NTF1Sp) và His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (sản xuất NTMiSp).Các cấu trúc này được phân hủy bằng trombin (1:1000) và được thẩm tách qua đêm ở nhiệt độ 4° C. với 20 mM Tris-HCl, độ pH 8, sử dụng màng thẩm tách Spectra/Por có ngưỡng trọng lượng phân tử là 6-8 kDa.Sau khi lọc máu, dung dịch được nạp vào cột Ni-NTA và nước thải chứa protein quan tâm được thu thập.Nồng độ protein được xác định bằng cách đo độ hấp thụ tia cực tím ở bước sóng 280nm bằng hệ số tuyệt chủng của từng protein, ngoại trừ NTF1Sp, sử dụng xét nghiệm Bradford theo giao thức của nhà sản xuất.Độ tinh khiết được xác định bằng phương pháp điện di trên gel SDS polyacrylamide (4–20%) và nhuộm màu xanh rực rỡ Coomassie.Protein được cô đặc bằng bộ lọc ly tâm (VivaSpin 20, GE Healthcare) ở tốc độ 4000 xg với mức cắt trọng lượng phân tử 10 kDa trong chu kỳ 20 phút.
Làm tan băng dung dịch protein và cẩn thận dùng pipet lấy 150 µl vào lọ có vách ngăn trong suốt dung tích 1 ml (Thermo Scientific 8 x 40 mm).Các ống được đậy nắp và bịt kín bằng parafilm để tránh bay hơi.Các mẫu (n = 3) được ủ ở 37°C hoặc 60°C và đảo ngược định kỳ để quan sát quá trình tạo gel.Các mẫu không tạo gel được ủ ít nhất một tuần.Giảm liên kết disulfide NTMiSp với 10 mM DTT trên 10 µM protein.Để phân tích quá trình tạo gel của lớp phủ tơ nhện tự nhiên, nhện cầu Thụy Điển đã được cắt, hai tuyến được bơm bóng chính được đặt trong 200 μl dung dịch đệm Tris-HCl 20 mM pH 8 và cắt để cho phép lớp phủ tách ra khỏi tuyến..Nội dung của các tuyến được hòa tan trong dung dịch đệm, 50 µl để xác định trọng lượng khô (bằng cách ủ các lọ mở ở 60°C đến khối lượng không đổi) và 150 µl để tạo gel ở 37°C.
Hình học/dụng cụ đo được làm bằng thép không gỉ sử dụng một tấm song song có đường kính trên 20 mm và khe hở 0,5 mm.Gia nhiệt mẫu từ 25°C đến 45°C và quay lại 25°C với tốc độ 1°C/phút bằng tấm Peltier có đáy bằng thép không gỉ.Các phép đo rung được thực hiện ở tần số 0,1 Hz và trong vùng nhớt đàn hồi tuyến tính của vật liệu ở mức biến dạng 5% và 0,5% đối với các mẫu lần lượt là 100 mg/mL và 300–500 mg/mL.Sử dụng buồng độ ẩm tùy chỉnh để ngăn chặn sự bay hơi.Dữ liệu được phân tích bằng Prism 9.
Để thu thập phổ hồng ngoại (IR) ở nhiệt độ phòng từ 800 đến 3900 cm–1.Thiết bị ATR, cũng như đường dẫn ánh sáng qua máy quang phổ, được làm sạch bằng không khí đã lọc khô trước và trong quá trình thí nghiệm.Các dung dịch (500 mg/mL để giảm thiểu đỉnh hấp thụ nước trong quang phổ) được nhỏ vào các tinh thể và gel (500 mg/mL) được hình thành trước khi đo và sau đó được chuyển sang các tinh thể (n = 3).1000 lần quét được ghi lại với độ phân giải 2 cm-1 và chu kỳ nhiệm vụ bằng 0 là 2. Đạo hàm thứ hai được tính toán bằng OPUS (Bruker) sử dụng phạm vi làm mịn chín điểm.Quang phổ được chuẩn hóa về cùng vùng tích hợp trong khoảng từ 1720 đến 1580 cm-1 bằng cách sử dụng “Spectragryph – Phần mềm quang phổ quang học” của F. Menges.Trong quang phổ ATR-IR, độ sâu thâm nhập của chùm tia hồng ngoại vào mẫu phụ thuộc vào số sóng, dẫn đến sự hấp thụ mạnh hơn ở số sóng thấp hơn so với số sóng cao hơn.Những hiệu ứng này chưa được hiệu chỉnh đối với quang phổ thể hiện trong hình.3 vì chúng rất nhỏ (Hình bổ sung 4).Phổ hiệu chỉnh cho hình này được tính toán bằng phần mềm Bruker OPUS.
Về nguyên tắc, có thể định lượng toàn diện sự phù hợp của protein sau khi giải mã đáng tin cậy các thành phần trong đỉnh amit I.Tuy nhiên, có một số trở ngại phát sinh trong thực tế.Nhiễu trong phổ có thể xuất hiện dưới dạng các đỉnh (giả) trong quá trình giải mã.Ngoài ra, đỉnh do sự uốn cong của nước trùng với vị trí của đỉnh amit I và có thể có độ lớn tương tự đối với các mẫu chứa một lượng lớn nước, chẳng hạn như gel nước được nghiên cứu ở đây.Do đó, chúng tôi đã không cố gắng phân hủy hoàn toàn đỉnh amit I và các quan sát của chúng tôi chỉ nên được xem xét để hỗ trợ cho các phương pháp khác như quang phổ NMR.
Dung dịch 50 mg/ml NT và His-NT2RepCT được tạo gel qua đêm ở 37°C.Hydrogel sau đó được pha loãng với 20 mM Tris-HCl (pH 8) đến nồng độ 12,5 mg/ml, lắc đều và dùng pipet để phá vỡ gel.Tiếp theo, hydrogel được pha loãng 10 lần với 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl mẫu được đưa vào lưới đồng phủ formvar và mẫu dư được loại bỏ bằng giấy thấm.Các mẫu được rửa hai lần với 5 µl nước MilliQ và nhuộm bằng 1% uranyl formate trong 5 phút.Loại bỏ vết bẩn dư thừa bằng giấy thấm, sau đó phơi khô lưới.Hình ảnh được thực hiện trên các lưới này bằng FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN hoạt động ở 100 kV.Các hình ảnh được ghi lại ở độ phóng đại x 26.500 và x 43.000 bằng máy ảnh CCD Veleta 2k × 2k (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Đức).Đối với mỗi mẫu (n = 1), 10 hình ảnh1515 đã được ghi lại.ImageJ (//imagej.nih.gov/) đã được sử dụng để phân tích hình ảnh và đo đường kính sợi (n = 100, các loại sợi khác nhau).Prism 9 được sử dụng để thực hiện các bài kiểm tra t không ghép đôi (hai đuôi).Fibrils trung bình His-NT2RepCT và NT lần lượt là 11,43 (SD 2,035) và 7,67 (SD 1,389) nm.Khoảng tin cậy (95%) là -4,246 đến -3,275.bậc tự do = 198, p < 0,0001.
80 µl mẫu chất lỏng chứa 10 µM thioflavin T (ThT) được đo ba lần (n = 3) trong điều kiện tĩnh bằng cách sử dụng tấm đáy trong suốt có đáy màu đen 96 giếng của Corning (Corning Glass 3881, Hoa Kỳ).Sự khác biệt về huỳnh quang được ghi lại bằng bộ lọc kích thích 440nm và bộ lọc phát xạ 480nm (FLUOStar Galaxy từ BMG Labtech, Offenburg, Đức).Tín hiệu ThT không bão hòa cũng không bị dập tắt vì các thí nghiệm với nồng độ ThT khác nhau được thực hiện mà không làm thay đổi cường độ tín hiệu.Ghi lại độ hấp thụ ở bước sóng 360 nm để đo khói mù.Đối với các thí nghiệm gieo hạt, gel 100 mg/mL được hình thành ở 37° C, được tạo huyền phù lại và được sử dụng để gieo hạt với tỷ lệ mol 5%, 10% và 20%.Dữ liệu được phân tích bằng Prism 9.
Làm tan lượng His-NT2RepCT và NT >100 mg/mL trên đá và lọc qua bộ lọc 0,22 µm.Nồng độ được tính toán bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng Nanodrop.Trong các giếng có tấm không liên kết màu đen 96 giếng (Corning) có đáy trong, các mẫu được pha loãng thành 20 mg/ml trong 20 mM Tris-HCl pH 8 và trộn với 5 μM ThT (nồng độ cuối cùng), tổng nồng độ mẫu Thể tích 50µl.Các mẫu được chụp ảnh 10 phút một lần ở 37 ° C trên kính hiển vi CellObserver (Zeiss) với kênh ánh sáng truyền qua và bộ lọc phát xạ và kích thích FITC để chụp ảnh ThT.Một ống kính 20x/0,4 được sử dụng để chụp ảnh.Zen Blue (Zeiss) và ImageJ (//imagej.nih.gov/) đã được sử dụng để phân tích hình ảnh.Gel cũng được điều chế từ dung dịch NT và His-NT2RepCT ở nồng độ 50 mg/mL chứa 20 mM Tris pH 8 và 5 µM ThT và ủ ở 37°C trong 90 phút.Các miếng gel được chuyển sang giếng mới chứa 20 mM Tris, pH 8 và 5 μM ThT trong tấm đáy trong suốt 96 giếng màu đen không ràng buộc.Thu được hình ảnh huỳnh quang màu xanh lá cây và trường sáng ở độ phóng đại 20x/0,4.ImageJ đã được sử dụng để phân tích hình ảnh.
Phổ NMR của giải pháp thu được ở 310 K trên máy quang phổ Bruker Avance Neo 600 MHz được trang bị Tủ lạnh trường xung cộng hưởng tứ cực QCI (HFCN).Mẫu NMR chứa 10 mg/mL protein đồng nhất đánh dấu 13C, 15N, hòa tan trong 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Các dịch chuyển hóa học của NT2RepCT ở pH 6,7 được sử dụng để chỉ định đỉnh 23 trong phổ 2D của 15N-HSQC.
Phổ rắn NMR (MAS) quay góc ma thuật của hydrogel có nhãn 13C, 15N đã được ghi lại trên máy quang phổ Bruker Avance III HD ở tần số 800 MHz được trang bị đầu dò không điện tử 3,2 mm 13C/15N{1H}.Nhiệt độ mẫu được kiểm soát bằng cách sử dụng dòng khí có nhiệt độ thay đổi ở 277 K. Cộng hưởng quay lưỡng cực hai chiều (DARR)76 và phổ kết nối lại tần số vô tuyến (RFDR)77 thu được ở tần số MAS lần lượt là 12,5 kHz và 20 kHz.Phân cực chéo (CP) từ 1H đến 13C được thực hiện bằng cách sử dụng đoạn tuyến tính từ 60,0 đến 48,0 kHz ở 1H, 61,3/71,6 kHz ở 13C (ở 12,5/20 kHz MAS) và thời gian tiếp xúc 0,5–1 ms.Việc tách rời Spinal6478 ở tần số 73,5 kHz đã được sử dụng trong quá trình thu thập dữ liệu.Thời gian thu nhận là 10 mili giây và độ trễ chu kỳ là 2,5 giây.Các mối tương quan Cα/Cβ liên kết đơn quan sát được trong phổ RFDR được chỉ định dựa trên các dịch chuyển hóa học loại dư lượng đặc trưng và các mối tương quan liên kết bội trong phổ DARR.
Cơ sở dữ liệu Zipper79 (//services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) đã được sử dụng để đánh giá xu hướng rung và năng lượng Rosetta cho NT, NTFlSp và NTMiSp.Cơ sở dữ liệu Zipper tính toán Rosetta Energy80, kết hợp một số hàm năng lượng tự do để lập mô hình và phân tích cấu trúc protein.Mức năng lượng -23 kcal/mol hoặc thấp hơn cho thấy xu hướng rung chuyển cao.Năng lượng thấp hơn có nghĩa là hai sợi β trong cấu trúc dây kéo có độ ổn định cao hơn.Ngoài ra, thuật toán Waltz đã được sử dụng để dự đoán các vùng tạo amyloid trong NT, NTFlSp và NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Dung dịch protein NT được trộn với dung dịch đệm axit ethanesulfonic 2-(N-morpholino) (MES) ở độ pH 5,5 và 6,0 để hạ độ pH xuống độ pH tương ứng là 6 và 7.Nồng độ protein cuối cùng là 100 mg/ml.
Các phép đo được thực hiện trên máy quang phổ J-1500 CD (JASCO, Hoa Kỳ) sử dụng cuvet 300 μL với đường quang 0,1 cm.Protein được pha loãng thành 10 μM (n = 1) trong dung dịch đệm photphat 20 mM (pH 8).Để phân tích độ ổn định của protein khi có muối, protein được phân tích ở cùng nồng độ (n = 1) trong dung dịch đệm photphat 20 mM (pH 8) chứa 154 mM NaF hoặc NaCl tương ứng.Quét nhiệt độ được ghi lại ở bước sóng 222 nm từ 25°C đến 95°C với tốc độ gia nhiệt là 1°C/phút.Tỷ lệ protein gấp tự nhiên được tính bằng công thức (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Ngoài ra, năm phổ được ghi lại cho mỗi mẫu từ 260 nm đến 190 nm ở 25°C và sau khi gia nhiệt đến 95°C.Năm quang phổ được tính trung bình, làm mịn và chuyển đổi thành độ elip mol.Dữ liệu được phân tích bằng Prism 9.
Cường độ huỳnh quang của His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) được đo ba lần (n = 3) trong các đĩa Corning 96 giếng có đáy trong suốt màu đen (Corning Glass 3881, USA) trong điều kiện tĩnh.Đo mẫu bằng máy đọc đĩa huỳnh quang có bước sóng kích thích 395 nm và ghi lại sự phát xạ ở bước sóng 509 nm trước khi tạo gel và 2 giờ sau ở 37°C.Dữ liệu được phân tích bằng Prism 9.
Bộ xét nghiệm hoạt tính purine nucleoside phosphorylase (phương pháp đo huỳnh quang, Sigma Aldrich) đã được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất.Để đo hoạt tính trong gel và dung dịch chứa His-NT-PNP, trộn 10 ng His-NT-PNP với 100 mg/mL NT thành tổng thể tích 2 µL vì gel cho tín hiệu trên khoảng phát hiện của bộ.Bao gồm các biện pháp kiểm soát gel và dung dịch không có His-NT-PNP.Các phép đo được thực hiện hai lần (n = 2).Sau khi đo hoạt độ, hỗn hợp phản ứng được loại bỏ và chụp ảnh gel để đảm bảo gel vẫn nguyên vẹn trong quá trình đo.Dữ liệu được phân tích bằng Prism 9.
Để biết thêm thông tin về thiết kế nghiên cứu, hãy xem bản tóm tắt nghiên cứu Tự nhiên được liên kết với bài viết này.
Hình 1 và 2 trình bày dữ liệu ban đầu.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f và 6, Hình bổ sung.3, hình bổ sung.5a, d, hình bổ sung.6 và hình bổ sung.8. Dữ liệu Dữ liệu từ nghiên cứu này được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Dữ liệu NMR thu được trong nghiên cứu này đã được đăng lên kho lưu trữ BMRBig với ID mục nhập bmrbig36.Cấu trúc của GFP và PNP được lấy từ PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. và Johansson, J. Kéo tơ nhện nhân tạo.Hóa chất Quốc gia.sinh vật học.11, 309–315 (2015).
Babb, PL và cộng sự.Bộ gen của Nephila clavipes làm nổi bật sự đa dạng của gen tơ nhện và sự biểu hiện phức tạp của chúng.Quốc gia Genette.49, 895–903 (2017).