Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Ngoài ra, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Thanh trượt hiển thị ba bài viết trên mỗi slide.Sử dụng các nút quay lại và tiếp theo để di chuyển qua các trang chiếu hoặc các nút điều khiển trang chiếu ở cuối để di chuyển qua từng trang chiếu.

Nhà cung cấp ống thép không gỉ 317

Bảng thành phần hóa học của vật liệu inox

SPACA6 là một protein bề mặt được biểu hiện bằng tinh trùng, rất quan trọng cho phản ứng tổng hợp giao tử trong quá trình sinh sản hữu tính ở động vật có vú.Bất chấp vai trò cơ bản này, chức năng cụ thể của SPACA6 vẫn chưa được hiểu rõ.Chúng tôi làm sáng tỏ cấu trúc tinh thể của miền ngoại bào của SPACA6 ở độ phân giải 2,2 Å, cho thấy protein hai miền bao gồm một bó bốn sợi và các bánh mì β giống Ig được nối với nhau bằng các liên kết gần như linh hoạt.Cấu trúc này giống với IZUMO1, một protein liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử khác, làm cho các thành viên sáng lập SPACA6 và IZUMO1 của siêu họ các protein liên quan đến thụ tinh được gọi ở đây là siêu họ IST.Siêu họ IST được xác định về mặt cấu trúc bởi bó bốn chuỗi xoắn và một cặp họa tiết CXXC liên kết với disulfide.Một tìm kiếm AlphaFold dựa trên cấu trúc của hệ protein người đã xác định được các thành viên protein bổ sung của siêu họ này;đáng chú ý là nhiều protein trong số này có liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử.Cấu trúc SPACA6 và mối quan hệ của nó với các thành viên khác trong siêu họ IST cung cấp mối liên kết còn thiếu trong kiến ​​thức của chúng ta về phản ứng tổng hợp giao tử của động vật có vú.
Mỗi cuộc đời của con người đều bắt đầu bằng hai loại giao tử đơn bội riêng biệt: tinh trùng của bố và trứng của mẹ.Tinh trùng này là người chiến thắng trong quá trình chọn lọc khắt khe, trong đó hàng triệu tế bào tinh trùng đi qua đường sinh dục nữ, vượt qua nhiều trở ngại1 và trải qua quá trình hoạt động, giúp tăng cường khả năng vận động và quá trình hình thành các thành phần bề mặt của chúng2,3,4.Ngay cả khi tinh trùng và noãn bào tìm thấy nhau thì quá trình này vẫn chưa kết thúc.Tế bào trứng được bao quanh bởi một lớp tế bào Cumulus và hàng rào glycoprotein gọi là zona pellucida, qua đó tinh trùng phải đi qua để vào tế bào trứng.Tinh trùng sử dụng sự kết hợp của các phân tử bám dính bề mặt và các enzyme tiết ra và liên kết với màng để vượt qua các rào cản cuối cùng này5.Những phân tử và enzym này chủ yếu được lưu trữ ở màng trong và ma trận thể đầu và được phát hiện khi màng ngoài của tinh trùng bị ly giải trong phản ứng thể thể6.Bước cuối cùng trong hành trình căng thẳng này là sự kiện hợp nhất tinh trùng-trứng, trong đó hai tế bào hợp nhất màng của chúng để trở thành một sinh vật lưỡng bội duy nhất7.Mặc dù quá trình này mang tính đột phá trong quá trình sinh sản của con người nhưng các tương tác phân tử cần thiết vẫn chưa được hiểu rõ.
Ngoài việc thụ tinh của giao tử, tính chất hóa học của sự hợp nhất của hai lớp lipid kép đã được nghiên cứu rộng rãi.Nói chung, phản ứng tổng hợp màng là một quá trình không thuận lợi về mặt năng lượng, đòi hỏi chất xúc tác protein phải trải qua sự thay đổi về cấu trúc để đưa hai màng lại gần nhau hơn, phá vỡ tính liên tục của chúng và gây ra phản ứng tổng hợp8,9.Những chất xúc tác protein này được gọi là fusogen và đã được tìm thấy trong vô số hệ thống nhiệt hạch.Chúng cần thiết để virus xâm nhập vào tế bào vật chủ (ví dụ: gp160 ở HIV-1, tăng đột biến ở virus corona, hemagglutinin ở virus cúm)10,11,12 nhau thai (syncytin)13,14,15 và sự hợp nhất hình thành giao tử ở sinh vật nhân chuẩn bậc thấp ( HAP2/GCS1 ở thực vật, sinh vật nguyên sinh và động vật chân đốt) 16,17,18,19.Fusogens cho giao tử ở người vẫn chưa được phát hiện, mặc dù một số protein đã được chứng minh là rất quan trọng đối với sự gắn kết và hợp nhất giao tử.CD9 được biểu hiện qua tế bào trứng, một loại protein xuyên màng cần thiết cho sự kết hợp giữa giao tử của chuột và người, là loại đầu tiên được phát hiện21,22,23.Mặc dù chức năng chính xác của nó vẫn chưa rõ ràng, nhưng vai trò trong sự bám dính, cấu trúc của sự bám dính tập trung vào các vi nhung mao trứng và/hoặc sự định vị chính xác của protein bề mặt tế bào trứng dường như là có khả năng xảy ra.Hai loại protein điển hình nhất rất quan trọng cho phản ứng tổng hợp giao tử là protein tinh trùng IZUMO127 và protein tế bào trứng JUNO28, và sự liên kết lẫn nhau của chúng là một bước quan trọng trong việc nhận biết và bám dính giao tử trước khi hợp nhất.Chuột đực loại trừ Izumo1 và chuột cái loại bỏ Juno hoàn toàn vô trùng, trong các mô hình này, tinh trùng xâm nhập vào không gian Perivitelline nhưng giao tử không hợp nhất.Tương tự, sự hợp lưu đã giảm khi giao tử được xử lý bằng kháng thể kháng IZUMO1 hoặc JUNO27,29 trong các thí nghiệm thụ tinh trong ống nghiệm ở người.
Gần đây, một nhóm protein biểu hiện tinh trùng mới được phát hiện có kiểu hình tương tự IZUMO1 và JUNO20,30,31,32,33,34,35 đã được phát hiện.Protein liên kết với màng tế bào tinh trùng 6 (SPACA6) đã được xác định là cần thiết cho quá trình thụ tinh trong một nghiên cứu gây đột biến ở chuột quy mô lớn.Việc chèn gen chuyển vào gen Spaca6 sẽ tạo ra tinh trùng không thể dung hợp được, mặc dù những tinh trùng này xâm nhập vào khoang quanh màng ngoài tim 36 .Các nghiên cứu loại trừ sau đó trên chuột đã xác nhận rằng Spaca6 là cần thiết cho phản ứng tổng hợp giao tử 30,32 .SPACA6 hầu như chỉ được biểu hiện ở tinh hoàn và có mô hình định vị tương tự như IZUMO1, cụ thể là trong nội mạc của tinh trùng trước phản ứng thể cùng thể, sau đó di chuyển đến vùng xích đạo sau phản ứng thể thể 30,32.Tương đồng Spaca6 tồn tại ở nhiều loại động vật có vú và sinh vật nhân chuẩn khác 30 và tầm quan trọng của nó đối với phản ứng tổng hợp giao tử ở người đã được chứng minh bằng cách ức chế thụ tinh trong ống nghiệm ở người bằng khả năng kháng SPACA6 30 .Không giống như IZUMO1 và JUNO, chi tiết về cấu trúc, tương tác và chức năng của SPACA6 vẫn chưa rõ ràng.
Để hiểu rõ hơn về quá trình cơ bản làm cơ sở cho sự kết hợp giữa tinh trùng và trứng của con người, điều này sẽ cho phép chúng tôi thông báo những phát triển trong tương lai về kế hoạch hóa gia đình và điều trị sinh sản, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu về cấu trúc và sinh hóa SPACA6.Cấu trúc tinh thể của miền ngoại bào của SPACA6 cho thấy một bó bốn chuỗi xoắn ốc (4HB) và miền giống như globulin miễn dịch (giống Ig) được kết nối bởi các vùng gần như linh hoạt.Như dự đoán trong các nghiên cứu trước đây, cấu trúc miền của SPACA6 tương tự cấu trúc miền của IZUMO1 ở người và hai protein này có chung một mô típ khác thường: 4HB với bề mặt xoắn ốc hình tam giác và một cặp họa tiết CXXC liên kết với disulfide.Chúng tôi đề xuất rằng IZUMO1 và SPACA6 hiện xác định một siêu họ protein lớn hơn, có liên quan đến cấu trúc liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử.Bằng cách sử dụng các đặc điểm duy nhất của siêu họ, chúng tôi đã tiến hành tìm kiếm toàn diện hệ protein cấu trúc AlphaFold của con người, xác định các thành viên bổ sung của siêu họ này, bao gồm một số thành viên liên quan đến phản ứng tổng hợp và/hoặc thụ tinh giao tử.Bây giờ, có vẻ như có một nếp gấp cấu trúc chung và siêu họ protein liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử và cấu trúc của chúng tôi cung cấp bản đồ phân tử về khía cạnh quan trọng này của cơ chế phản ứng tổng hợp giao tử của con người.
SPACA6 là một protein xuyên màng đơn với một glycan liên kết N và sáu liên kết disulfide giả định (Hình S1a và S2).Chúng tôi đã biểu thị miền ngoại bào của SPACA6 ở người (dư lượng 27–246) trong tế bào Drosophila S2 và tinh chế protein bằng ái lực niken, trao đổi cation và sắc ký loại trừ kích thước (Hình S1b).Miền ectodomain SPACA6 đã được tinh chế rất ổn định và đồng nhất.Phân tích bằng phương pháp sắc ký loại trừ kích thước kết hợp với tán xạ ánh sáng đa giác (SEC-MALS) cho thấy một đỉnh có trọng lượng phân tử tính toán là 26,2 ± 0,5 kDa (Hình S1c).Điều này phù hợp với kích thước của miền ectodomain đơn phân SPACA6, cho thấy rằng quá trình oligome hóa không xảy ra trong quá trình tinh chế.Ngoài ra, quang phổ lưỡng sắc tròn (CD) cho thấy cấu trúc α/β hỗn hợp có điểm nóng chảy là 51,3 ° C (Hình S1d, e).Sự phân giải phổ CD cho thấy 38,6% phần tử xoắn ốc α và 15,8% phần tử chuỗi (Hình S1d).
Miền ectodomain SPACA6 được kết tinh bằng cách sử dụng gieo hạt ma trận ngẫu nhiên38 dẫn đến tập dữ liệu có độ phân giải 2,2 Å (Bảng 1 và Hình S3).Sử dụng kết hợp dữ liệu thay thế phân tử dựa trên mảnh và dữ liệu phân kỳ SAD với mức phơi nhiễm bromide để xác định cấu trúc (Bảng 1 và Hình S4), mô hình tinh chỉnh cuối cùng bao gồm dư lượng 27–246.Tại thời điểm cấu trúc được xác định, không có cấu trúc thử nghiệm hoặc AlphaFold nào có sẵn.Miền ectodomain SPACA6 có kích thước 20 Å × 20 Å × 85 Å, bao gồm bảy vòng xoắn và chín sợi β, và có nếp gấp cấp ba kéo dài được ổn định bằng sáu liên kết disulfide (Hình 1a, b).Mật độ electron yếu ở cuối chuỗi bên Asn243 cho thấy dư lượng này là một quá trình glycosyl hóa liên kết N.Cấu trúc bao gồm hai miền: bó bốn chuỗi xoắn N-terminal (4HB) và miền giống Ig-terminal C với vùng bản lề trung gian giữa chúng (Hình 1c).
Cấu trúc miền ngoại bào của SPACA6.Sơ đồ dải của miền ngoại bào SPACA6, màu của chuỗi từ đầu N đến đầu C từ xanh đậm đến đỏ sẫm.Cysteine ​​liên quan đến liên kết disulfide được tô màu đỏ tươi.b Cấu trúc liên kết của miền ngoại bào của SPACA6.Sử dụng bảng màu giống như trong Hình 1a.c miền ngoại bào SPACA6.Biểu đồ dải miền 4HB, bản lề và giống Ig lần lượt có màu cam, xanh lá cây và xanh lam.Các lớp không được vẽ theo tỷ lệ.
Miền 4HB của SPACA6 bao gồm bốn vòng xoắn chính (xoắn 1–4), được sắp xếp theo dạng xoắn ốc (Hình 2a), xen kẽ giữa các tương tác phản song song và song song (Hình 2b).Một chuỗi xoắn đơn nhỏ bổ sung (xoắn 1′) được đặt vuông góc với bó, tạo thành một tam giác với các vòng xoắn 1 và 2. Hình tam giác này bị biến dạng nhẹ trong quá trình bó xoắn ốc của bó xoắn ốc tương đối dày đặc 3 và 4 ( Hình 2a).
Biểu đồ dải đầu cuối N 4HB.b Nhìn từ trên xuống của một bó gồm bốn vòng xoắn, mỗi chuỗi xoắn được tô màu xanh đậm ở đầu N và màu đỏ sẫm ở đầu C.c Sơ đồ bánh xe xoắn ốc từ trên xuống cho 4HB, với mỗi gốc được thể hiện dưới dạng vòng tròn được dán nhãn mã axit amin gồm một chữ cái;chỉ có bốn axit amin ở đầu bánh xe được đánh số.Dư lượng không phân cực có màu vàng, dư lượng không tích điện có cực có màu xanh lá cây, dư lượng tích điện dương có màu xanh lam và dư lượng tích điện âm có màu đỏ.d Các mặt hình tam giác của miền 4HB, với 4HB màu cam và bản lề màu xanh lục.Cả hai miếng lót đều có liên kết disulfua hình que.
4HB tập trung vào lõi kỵ nước bên trong bao gồm chủ yếu là dư lượng béo và thơm (Hình 2c).Lõi chứa liên kết disulfide giữa Cys41 và Cys55 liên kết các vòng xoắn 1 và 2 với nhau trong một hình tam giác nhô lên phía trên (Hình 2d).Hai liên kết disulfide bổ sung được hình thành giữa họa tiết CXXC trong Helix 1 và một họa tiết CXXC khác được tìm thấy ở đầu kẹp tóc β ở vùng bản lề (Hình 2d).Dư lượng arginine bảo thủ có chức năng chưa xác định (Arg37) nằm bên trong một tam giác rỗng được hình thành bởi các vòng xoắn 1′, 1 và 2. Các nguyên tử carbon béo Cβ, Cγ và Cδ Arg37 tương tác với lõi kỵ nước và các nhóm guanidine của nó di chuyển theo chu kỳ giữa các vòng xoắn 1′ và 1 thông qua tương tác giữa xương sống Thr32 và chuỗi bên (Hình S5a, b).Tyr34 mở rộng vào khoang để lại hai khoang nhỏ mà qua đó Arg37 có thể tương tác với dung môi.
Các miền β-sandwich giống Ig là một siêu họ protein lớn có chung đặc điểm là hai hoặc nhiều tấm β lưỡng tính đa sợi tương tác thông qua lõi kỵ nước 39. Miền giống Ig đầu cuối C của SPACA6 có cùng kiểu mẫu và bao gồm hai lớp (Hình S6a).Trang 1 là tờ β gồm bốn sợi (sợi D, F, H và I), trong đó các sợi F, H và I tạo thành một sự sắp xếp không song song, còn các sợi I và D có sự tương tác song song.Bảng 2 là một bảng beta sợi đôi nhỏ không song song (sợi E và G).Một liên kết disulfide bên trong đã được quan sát thấy giữa đầu C của chuỗi E và tâm của chuỗi H (Cys170-Cys226) (Hình S6b).Liên kết disulfide này tương tự như liên kết disulfide trong miền β-sandwich của immunoglobulin40,41.
Tấm β bốn sợi xoắn dọc theo toàn bộ chiều dài của nó, tạo thành các cạnh không đối xứng, khác nhau về hình dạng và tĩnh điện.Cạnh mỏng hơn là bề mặt môi trường kỵ nước phẳng, nổi bật so với các bề mặt không đồng đều và đa dạng về tĩnh điện còn lại trong SPACA6 (Hình S6b, c).Một quầng sáng gồm các nhóm carbonyl/amino xương sống lộ ra và chuỗi bên cực bao quanh bề mặt kỵ nước (Hình S6c).Rìa rộng hơn được bao phủ bởi một đoạn xoắn ốc có nắp chặn phần đầu N của lõi kỵ nước và hình thành ba liên kết hydro với nhóm cực mở của xương sống chuỗi F (Hình S6d).Phần đầu C của cạnh này tạo thành một túi lớn với lõi kỵ nước lộ ra một phần.Túi được bao quanh bởi các điện tích dương do ba bộ dư lượng arginine kép (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 và Arg212-Arg214) và histidine trung tâm (His220) (Hình S6e).
Vùng bản lề là một đoạn ngắn giữa miền xoắn ốc và miền giống Ig, bao gồm một lớp β ba sợi phản song song (sợi A, B và C), một chuỗi xoắn nhỏ 310 và một số đoạn xoắn ốc dài ngẫu nhiên.(Hình S7).Một mạng lưới các tiếp điểm cộng hóa trị và tĩnh điện trong vùng bản lề xuất hiện để ổn định hướng giữa 4HB và miền giống Ig.Mạng có thể được chia thành ba phần.Phần đầu tiên bao gồm hai họa tiết CXXC (27CXXC30 và 139CXXC142) tạo thành một cặp liên kết disulfide giữa β-kẹp tóc ở bản lề và chuỗi xoắn 1′ ở 4HB.Phần thứ hai bao gồm các tương tác tĩnh điện giữa miền giống Ig và bản lề.Glam132 ở bản lề tạo thành cầu muối với Arg233 ở miền giống Ig và Arg135 ở bản lề.Phần thứ ba bao gồm liên kết cộng hóa trị giữa miền giống Ig và vùng bản lề.Hai liên kết disulfide (Cys124-Cys147 và Cys128-Cys153) kết nối vòng bản lề với một trình liên kết được ổn định bằng tương tác tĩnh điện giữa Gln131 và nhóm chức năng xương sống, cho phép truy cập vào miền giống Ig thứ nhất.xích.
Cấu trúc của ectodomain SPACA6 và các cấu trúc riêng lẻ của các miền giống 4HB và Ig được sử dụng để tìm kiếm các bản ghi có cấu trúc tương tự trong cơ sở dữ liệu protein 42 .Chúng tôi đã xác định các kết quả trùng khớp có điểm Dali Z cao, độ lệch chuẩn nhỏ và điểm LALI lớn (điểm sau là số lượng dư lượng tương đương về mặt cấu trúc).Mặc dù 10 lần truy cập đầu tiên từ tìm kiếm tên miền ectodomain đầy đủ (Bảng S1) có điểm Z chấp nhận được là> 842, nhưng chỉ tìm kiếm tên miền giống 4HB hoặc Ig cho thấy hầu hết các lần truy cập này chỉ tương ứng với β-sandwiches.một nếp gấp phổ biến được tìm thấy trong nhiều protein.Cả ba tìm kiếm ở Dali đều chỉ trả về một kết quả: IZUMO1.
Từ lâu, người ta đã cho rằng SPACA6 và IZUMO1 có những điểm tương đồng về cấu trúc7,32,37.Mặc dù các miền ectodomain của hai protein liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử này chỉ chia sẻ nhận dạng trình tự 21% (Hình S8a), nhưng bằng chứng phức tạp, bao gồm mẫu liên kết disulfide được bảo tồn và miền giống Ig đầu C được dự đoán trong SPACA6, đã cho phép những nỗ lực ban đầu để xây dựng một mô hình tương đồng của A chuột SPACA6 sử dụng IZUMO1 làm mẫu37.Cấu trúc của chúng tôi xác nhận những dự đoán này và cho thấy mức độ tương đồng thực sự.Trên thực tế, các cấu trúc SPACA6 và IZUMO137,43,44 có chung kiến ​​​​trúc hai miền (Hình S8b) với các miền β-sandwich giống 4HB và Ig tương tự được kết nối bởi một vùng bản lề (Hình S8c).
IZUMO1 và SPACA6 4HB có những điểm khác biệt chung so với các bó xoắn ốc thông thường.4HB điển hình, giống như các 4HB được tìm thấy trong phức hợp protein SNARE liên quan đến phản ứng tổng hợp nội sinh 45,46, có các vòng xoắn cách đều nhau duy trì độ cong không đổi quanh trục trung tâm 47. Ngược lại, các miền xoắn ốc ở cả IZUMO1 và SPACA6 đều bị biến dạng, với độ cong thay đổi và đóng gói không đồng đều (Hình S8d).Độ xoắn, có lẽ gây ra bởi tam giác được hình thành bởi các vòng xoắn 1′, 1 và 2, được giữ lại trong IZUMO1 và SPACA6 và được ổn định bởi cùng một họa tiết CXXC trên chuỗi xoắn 1′.Tuy nhiên, liên kết disulfide bổ sung được tìm thấy trong SPACA6 (Cys41 và Cys55 liên kết cộng hóa trị các vòng xoắn 1 và 2 ở trên) tạo ra một đỉnh sắc nét hơn ở đỉnh tam giác, làm cho SPACA6 xoắn hơn IZUMO1, với các hình tam giác khoang rõ ràng hơn.Ngoài ra, IZUMO1 thiếu Arg37 được quan sát thấy ở trung tâm khoang này trong SPACA6.Ngược lại, IZUMO1 có lõi kỵ nước điển hình hơn gồm các gốc béo và thơm.
IZUMO1 có miền giống Ig bao gồm tấm β chuỗi kép và năm chuỗi43.Chuỗi bổ sung trong IZUMO1 thay thế cuộn dây trong SPACA6, tương tác với chuỗi F để hạn chế các liên kết hydro xương sống trong chuỗi.Một điểm so sánh thú vị là điện tích bề mặt dự đoán của các miền giống Ig của hai protein.Bề mặt IZUMO1 tích điện âm hơn bề mặt SPACA6.Một điện tích bổ sung nằm gần đầu C đối diện với màng tinh trùng.Trong SPACA6, các vùng giống nhau có tính trung tính hoặc tích điện dương cao hơn (Hình S8e).Ví dụ: bề mặt kỵ nước (cạnh mỏng hơn) và các hố tích điện dương (cạnh rộng hơn) trong SPACA6 đều tích điện âm trong IZUMO1.
Mặc dù mối quan hệ và các thành phần cấu trúc thứ cấp giữa IZUMO1 và SPACA6 được bảo tồn tốt, nhưng sự liên kết cấu trúc của các miền giống Ig cho thấy hai miền khác nhau về hướng chung so với nhau (Hình S9).Bó xoắn ốc của IZUMO1 được uốn cong quanh β-sandwich, tạo ra hình dạng “boomerang” được mô tả trước đó ở khoảng 50° tính từ trục trung tâm.Ngược lại, chùm xoắn ốc trong SPACA6 nghiêng khoảng 10° theo hướng ngược lại.Sự khác biệt trong các hướng này có thể là do sự khác biệt ở vùng bản lề.Ở cấp độ trình tự sơ cấp, IZUMO1 và SPACA6 có rất ít điểm tương đồng về trình tự ở bản lề, ngoại trừ dư lượng cysteine, glycine và axit aspartic.Kết quả là liên kết hydro và mạng tĩnh điện hoàn toàn khác nhau.Các phần tử cấu trúc thứ cấp tấm β được chia sẻ bởi IZUMO1 và SPACA6, mặc dù các chuỗi trong IZUMO1 dài hơn nhiều và chuỗi xoắn 310 (xoắn 5) là duy nhất của SPACA6.Những khác biệt này dẫn đến sự định hướng miền khác nhau cho hai loại protein tương tự nhau.
Tìm kiếm trên máy chủ Dali của chúng tôi đã tiết lộ rằng SPACA6 và IZUMO1 là hai cấu trúc duy nhất được xác định bằng thực nghiệm được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu protein có nếp gấp 4HB đặc biệt này (Bảng S1).Gần đây hơn, DeepMind (Alphabet/Google) đã phát triển AlphaFold, một hệ thống dựa trên mạng thần kinh có thể dự đoán chính xác cấu trúc 3D của protein từ các chuỗi sơ cấp48.Ngay sau khi chúng tôi giải quyết cấu trúc SPACA6, cơ sở dữ liệu AlphaFold đã được phát hành, cung cấp các mô hình cấu trúc dự đoán bao gồm 98,5% tổng số protein trong hệ protein của con người48,49.Sử dụng cấu trúc SPACA6 đã được giải quyết của chúng tôi làm mô hình tìm kiếm, tìm kiếm tương đồng về cấu trúc cho mô hình trong hệ protein người AlphaFold đã xác định các ứng cử viên có cấu trúc tương tự với SPACA6 và IZUMO1.Với độ chính xác đáng kinh ngạc của AlphaFold trong việc dự đoán SPACA6 (Hình S10a) —đặc biệt là miền ectodomain 1,1 Å rms so với cấu trúc đã giải quyết của chúng tôi (Hình S10b) —chúng tôi có thể tin tưởng rằng các kết quả trùng khớp SPACA6 đã xác định có thể chính xác.
Trước đây, PSI-BLAST đã tìm kiếm cụm IZUMO1 cùng với ba protein liên quan đến tinh trùng khác: IZUMO2, IZUMO3 và IZUMO450.AlphaFold dự đoán rằng các protein họ IZUMO này xếp vào miền 4HB với kiểu liên kết disulfide giống như IZUMO1 (Hình 3a và S11), mặc dù chúng thiếu miền giống Ig.Người ta đưa ra giả thuyết rằng IZUMO2 và IZUMO3 là các protein màng một mặt tương tự IZUMO1, trong khi IZUMO4 dường như được tiết ra.Chức năng của protein IZUMO 2, 3 và 4 trong phản ứng tổng hợp giao tử chưa được xác định.IZUMO3 được biết là có vai trò trong quá trình sinh học acrosome trong quá trình phát triển tinh trùng51 và protein IZUMO tạo thành phức hợp50.Việc bảo tồn protein IZUMO ở động vật có vú, bò sát và lưỡng cư cho thấy chức năng tiềm năng của chúng phù hợp với chức năng của các protein liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử đã biết khác, chẳng hạn như DCST1/2, SOF1 và FIMP.
Sơ đồ kiến ​​trúc miền của siêu họ IST, với các miền giống 4HB, bản lề và Ig được tô sáng lần lượt bằng màu cam, xanh lục và xanh lam.IZUMO4 có vùng đầu C độc đáo có màu đen.Liên kết disulfide được xác nhận và giả định được thể hiện tương ứng bằng các đường liền nét và chấm.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) và TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) được hiển thị trong cùng dải màu như bảng A. Liên kết disulfide được hiển thị bằng màu đỏ tươi.Các vòng xoắn xuyên màng TMEM95, IZUMO2 và IZUMO3 không được hiển thị.
Không giống như protein IZUMO, các protein SPACA khác (ví dụ SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 và SPACA9) được cho là có cấu trúc khác với SPACA6 (Hình S12).Chỉ SPACA9 có 4HB, nhưng dự kiến ​​nó sẽ không có hướng song song chống song song hoặc liên kết disulfide giống như SPACA6.Chỉ SPACA1 có miền giống Ig tương tự.AlphaFold dự đoán SPACA3, SPACA4 và SPACA5 có cấu trúc hoàn toàn khác so với SPACA6.Điều thú vị là SPACA4 cũng được biết là có vai trò trong quá trình thụ tinh, nhưng ở mức độ lớn hơn SPACA6, thay vào đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự tương tác giữa tinh trùng và tế bào trứng zona pellucida52.
Tìm kiếm AlphaFold của chúng tôi đã tìm thấy một kết quả phù hợp khác cho IZUMO1 và SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, một loại protein xuyên màng đặc hiệu cho tinh trùng, khiến chuột đực bị vô sinh khi bị cắt bỏ 32,33.Tinh trùng thiếu TMEM95 có hình thái, khả năng vận động và khả năng xuyên qua màng trong suốt và bám vào màng trứng bình thường nhưng không thể kết hợp với màng tế bào trứng.Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng TMEM95 có những điểm tương đồng về cấu trúc với IZUMO133.Thật vậy, mô hình AlphaFold đã xác nhận rằng TMEM95 là 4HB có cùng cặp họa tiết CXXC với IZUMO1 và SPACA6, đồng thời có cùng liên kết disulfide bổ sung giữa các vòng xoắn 1 và 2 được tìm thấy trong SPACA6 (Hình 3a và S11).Mặc dù TMEM95 thiếu miền giống Ig, nhưng nó có vùng có kiểu liên kết disulfide tương tự như vùng bản lề SPACA6 và IZUMO1 (Hình 3b).Tại thời điểm xuất bản bản thảo này, máy chủ in sẵn đã báo cáo cấu trúc của TMEM95, xác nhận kết quả AlphaFold53.TMEM95 rất giống với SPACA6 và IZUMO1 và đã được bảo tồn về mặt tiến hóa ở động vật lưỡng cư (Hình 4 và S13).
Tìm kiếm PSI-BLAST đã sử dụng cơ sở dữ liệu NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP và SOF1 để xác định vị trí của các chuỗi này trong cây sự sống.Khoảng cách giữa các điểm nhánh không được hiển thị theo tỷ lệ.
Sự tương đồng về cấu trúc tổng thể nổi bật giữa SPACA6 và IZUMO1 cho thấy rằng chúng là thành viên sáng lập của siêu họ cấu trúc được bảo tồn bao gồm các protein TMEM95 và IZUMO 2, 3 và 4.các thành viên đã biết: IZUMO1, SPACA6 và TMEM95.Bởi vì chỉ có một số thành viên sở hữu các miền giống Ig, đặc điểm nổi bật của siêu họ IST là miền 4HB, có các đặc điểm độc đáo chung cho tất cả các protein này: 1) 4HB dạng cuộn với các vòng xoắn được sắp xếp theo kiểu xen kẽ đối song song/song song (Hình 1). . 5a), 2) bó có mặt hình tam giác bao gồm hai vòng xoắn bên trong bó và vòng xoắn dọc thứ ba (Hình. vùng chính (Hình 5c). Mô típ CXXC, được tìm thấy trong các protein giống thioredoxin, được biết là có chức năng như một cảm biến oxy hóa khử 54,55,56, trong khi mô típ ở các thành viên họ IST có thể được liên kết với các đồng phân disulfide protein như ERp57 trong phản ứng tổng hợp giao tử.
Các thành viên của siêu họ IST được xác định bởi ba đặc điểm đặc trưng của miền 4HB: bốn vòng xoắn xen kẽ giữa hướng song song và phản song song, các mặt bó xoắn ốc hình tam giác và họa tiết kép ca CXXC được hình thành giữa các phân tử nhỏ.) Chuỗi xoắn đầu N (màu cam) và vùng bản lề β-kẹp tóc (màu xanh lá cây).
Do sự giống nhau giữa SPACA6 và IZUMO1, khả năng liên kết với IZUMO1 hoặc JUNO của SPACA6 đã được thử nghiệm.Phép đo giao thoa lớp sinh học (BLI) là phương pháp liên kết dựa trên động học trước đây đã được sử dụng để định lượng sự tương tác giữa IZUMO1 và JUNO.Sau khi ủ cảm biến được dán nhãn biotin bằng IZUMO1 làm mồi nhử có nồng độ chất phân tích JUNO cao, một tín hiệu mạnh đã được phát hiện (Hình S14a), cho thấy sự thay đổi do liên kết gây ra trong độ dày của vật liệu sinh học gắn vào đầu cảm biến.Các tín hiệu tương tự (tức là JUNO được ghép nối với cảm biến làm mồi nhử chống lại chất phân tích IZUMO1) (Hình S14b).Không phát hiện thấy tín hiệu nào khi SPACA6 được sử dụng làm chất phân tích chống lại IZUMO1 gắn với cảm biến hoặc JUNO gắn với cảm biến (Hình S14a, b).Việc không có tín hiệu này cho thấy miền ngoại bào của SPACA6 không tương tác với miền ngoại bào của IZUMO1 hoặc JUNO.
Bởi vì xét nghiệm BLI dựa trên quá trình biotatin hóa dư lượng lysine tự do trên protein mồi, nên việc sửa đổi này có thể ngăn cản sự liên kết nếu dư lượng lysine có liên quan đến tương tác.Ngoài ra, hướng của liên kết so với cảm biến có thể tạo ra các trở ngại về mặt không gian, do đó, các thử nghiệm kéo xuống thông thường cũng được thực hiện trên các miền ectodomain SPACA6, IZUMO1 và JUNO tái tổ hợp.Mặc dù vậy, SPACA6 không kết tủa với IZUMO1 được gắn thẻ của Ngài hoặc JUNO được gắn thẻ của Ngài (Hình S14c, d), cho thấy không có tương tác nào phù hợp với tương tác được quan sát thấy trong các thí nghiệm BLI.Để kiểm soát tích cực, chúng tôi đã xác nhận sự tương tác của JUNO với nhãn IZUMO1 của anh ấy (Hình S14e và S15).
Bất chấp sự giống nhau về cấu trúc giữa SPACA6 và IZUMO1, việc SPACA6 không thể liên kết với JUNO không có gì đáng ngạc nhiên.Bề mặt IZUMO1 của con người có hơn 20 dư lượng tương tác với JUNO, bao gồm các dư lượng từ mỗi vùng trong số ba vùng (mặc dù hầu hết chúng nằm ở vùng bản lề) (Hình S14f).Trong số các dư lượng này, chỉ có một dư lượng được bảo tồn trong SPACA6 (Glam70).Trong khi nhiều chất thay thế dư lượng vẫn giữ được các đặc tính sinh hóa ban đầu, thì dư lượng Arg160 thiết yếu trong IZUMO1 đã được thay thế bằng Asp148 tích điện âm trong SPACA6;các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng đột biến Arg160Glu ở IZUMO1 gần như loại bỏ hoàn toàn liên kết với JUNO43.Ngoài ra, sự khác biệt về hướng miền giữa IZUMO1 và SPACA6 đã làm tăng đáng kể diện tích bề mặt của vị trí liên kết JUNO của vùng tương đương trên SPACA6 (Hình S14g).
Mặc dù nhu cầu về SPACA6 đã biết đối với phản ứng tổng hợp giao tử và tính tương tự của nó với IZUMO1, SPACA6 dường như không có chức năng liên kết JUNO tương đương.Do đó, chúng tôi đã tìm cách kết hợp dữ liệu cấu trúc của mình với bằng chứng về tầm quan trọng do sinh học tiến hóa cung cấp.Sự sắp xếp trình tự của các tương đồng SPACA6 cho thấy sự bảo tồn cấu trúc chung ngoài động vật có vú.Ví dụ, dư lượng cystein hiện diện ngay cả ở các loài lưỡng cư có quan hệ họ hàng xa (Hình 6a).Bằng cách sử dụng máy chủ ConSurf, nhiều dữ liệu lưu giữ căn chỉnh trình tự gồm 66 trình tự đã được ánh xạ tới bề mặt SPACA6.Loại phân tích này có thể cho thấy dư lượng nào đã được bảo tồn trong quá trình tiến hóa protein và có thể chỉ ra vùng bề mặt nào đóng vai trò trong chức năng.
Căn chỉnh trình tự các miền ectodomain SPACA6 từ 12 loài khác nhau được chuẩn bị bằng CLUSTAL OMEGA.Theo phân tích của ConSurf, các vị trí thận trọng nhất được đánh dấu bằng màu xanh lam.Dư lượng cysteine ​​​​được tô màu đỏ.Ranh giới miền và các thành phần cấu trúc thứ cấp được hiển thị ở đầu căn chỉnh, trong đó các mũi tên biểu thị sợi β và sóng biểu thị các vòng xoắn.Mã định danh truy cập NCBI chứa các trình tự là: con người (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), khỉ mũ (Cebus bắt chước, XP_017359366), ngựa (Equus caballus, XP_023506102), cá voi sát thủ (Orcinus orca3_23 XP_032_034 ) .), cừu (Ovis aries, XP_014955560), voi (Loxodonta africana, XP_010585293), chó (Canis lupus familyis, XP_025277208), chuột (Mus musculus, NP_001156381), quỷ Tasmania (Sarcophilus harrisii, XP_03611, XP_0318), Thú mỏ vịt, 8) , 61_89 và Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Việc đánh số dựa trên thứ tự của con người.b Biểu diễn bề mặt của cấu trúc SPACA6 với 4HB ở trên cùng và miền giống Ig ở dưới cùng, màu sắc dựa trên ước tính bảo tồn từ máy chủ ConSurf.Những phần được bảo quản tốt nhất có màu xanh lam, những phần được bảo quản vừa phải có màu trắng và những phần ít được bảo quản nhất có màu vàng.cystein màu tím.Ba miếng vá bề mặt thể hiện mức độ bảo vệ cao được hiển thị trong miếng vá có nhãn 1, 2 và 3. Phim hoạt hình 4HB được hiển thị trong phần phụ ở trên cùng bên phải (cùng bảng màu).
Cấu trúc SPACA6 có ba vùng bề mặt được bảo tồn cao (Hình 6b).Bản vá 1 kéo dài 4HB và vùng bản lề, đồng thời chứa hai cầu nối disulfide CXXC được bảo tồn, mạng bản lề Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Hình S7) và ba dư lượng thơm bên ngoài được bảo tồn (Phe31, Tyr73, Phe137)).vành rộng hơn của miền giống Ig (Hình S6e), đại diện cho một số dư lượng tích điện dương trên bề mặt tinh trùng.Điều thú vị là miếng dán này chứa một epitope kháng thể trước đây đã được chứng minh là can thiệp vào chức năng SPACA6 30.Vùng 3 trải dài bản lề và một bên của miền giống Ig;vùng này chứa các prolines được bảo tồn (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) và các gốc cực/tích điện hướng ra ngoài.Đáng ngạc nhiên là hầu hết các dư lượng trên bề mặt của 4HB đều rất khác nhau (Hình 6b), mặc dù nếp gấp được bảo tồn trong suốt tương đồng SPACA6 (như được biểu thị bằng tính bảo thủ của lõi bó kỵ nước) và ngoài siêu họ IST.
Mặc dù đây là vùng nhỏ nhất trong SPACA6 với ít thành phần cấu trúc thứ cấp có thể phát hiện được nhất, nhưng nhiều tàn dư của vùng bản lề (bao gồm cả vùng 3) được bảo tồn cao trong số các tương đồng SPACA6, điều này có thể cho thấy rằng hướng của bó xoắn ốc và β-sandwich đóng một vai trò nào đó.như một người bảo thủ.Tuy nhiên, mặc dù mạng lưới liên kết hydro và tĩnh điện rộng khắp trong vùng bản lề của SPACA6 và IZUMO1, có thể thấy bằng chứng về tính linh hoạt nội tại trong sự liên kết của nhiều cấu trúc được phép của IZUMO137,43,44.Căn chỉnh của các miền riêng lẻ chồng chéo lên nhau, nhưng hướng của các miền tương đối với nhau thay đổi từ 50° đến 70° so với trục trung tâm (Hình S16).Để hiểu động lực hình dạng của SPACA6 trong giải pháp, các thí nghiệm SAXS đã được thực hiện (Hình S17a, b).Việc tái cấu trúc ban đầu của miền ectodomain SPACA6 phù hợp với cấu trúc tinh thể hình que (Hình S18), mặc dù biểu đồ Kratky cho thấy một số mức độ linh hoạt (Hình S17b).Cấu hình này trái ngược với IZUMO1, trong đó protein không liên kết có hình dạng boomerang cả trong mạng và trong dung dịch43.
Để xác định cụ thể vùng linh hoạt, phương pháp quang phổ khối trao đổi hydro-deuterium (H-DXMS) đã được thực hiện trên SPACA6 và so sánh với dữ liệu thu được trước đó trên IZUMO143 (Hình 7a, b).SPACA6 rõ ràng linh hoạt hơn IZUMO1, được biểu thị bằng sự trao đổi deuterium cao hơn trong toàn bộ cấu trúc sau 100.000 giây trao đổi.Trong cả hai cấu trúc, phần đầu C của vùng bản lề cho thấy mức độ trao đổi cao, điều này có thể cho phép xoay vòng hạn chế các miền giống 4HB và Ig so với nhau.Điều thú vị là, phần đầu C của bản lề SPACA6, bao gồm phần dư 147CDLPLDCP154, là vùng 3 được bảo tồn cao (Hình 6b), có thể chỉ ra rằng tính linh hoạt giữa các miền là một tính năng được bảo tồn theo tiến hóa của SPACA6.Theo phân tích tính linh hoạt, dữ liệu nóng chảy CD cho thấy SPACA6 (Tm = 51,2°C) kém ổn định hơn IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Hình S1e và S19).
hình ảnh H-DXMS của SPACA6 và b IZUMO1.Tỷ lệ trao đổi deuterium được xác định tại các thời điểm được chỉ định.Mức độ trao đổi hydro-deuterium được biểu thị bằng màu sắc trên thang độ dốc từ xanh lam (10%) đến đỏ (90%).Hộp đen đại diện cho khu vực có mức trao đổi cao.Ranh giới của miền 4HB, bản lề và giống Ig được quan sát trong cấu trúc tinh thể được hiển thị phía trên trình tự chính.Mức trao đổi deuterium ở 10 giây, 1000 giây và 100.000 giây được vẽ trên biểu đồ dải chồng lên các bề mặt phân tử trong suốt của SPACA6 và IZUMO1.Các bộ phận của cấu trúc có mức trao đổi deuterium dưới 50% có màu trắng.Các khu vực trao đổi H-DXMS trên 50% được tô màu theo thang độ dốc.
Việc sử dụng CRISPR/Cas9 và các chiến lược di truyền loại bỏ gen chuột đã dẫn đến việc xác định một số yếu tố quan trọng cho sự liên kết và hợp nhất của tinh trùng và trứng.Ngoài sự tương tác đặc trưng của cấu trúc IZUMO1-JUNO và CD9, hầu hết các protein liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử vẫn còn bí ẩn về mặt cấu trúc và chức năng.Đặc tính sinh lý và cấu trúc của SPACA6 là một phần khác của câu đố phân tử kết dính/kết hợp trong quá trình thụ tinh.
SPACA6 và các thành viên khác của siêu họ IST dường như được bảo tồn cao ở động vật có vú cũng như các loài chim, bò sát và lưỡng cư;trên thực tế, người ta cho rằng SPACA6 thậm chí còn cần thiết cho quá trình thụ tinh ở cá ngựa vằn 59. Sự phân bố này tương tự như các protein liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử đã biết khác như DCST134, DCST234, FIMP31 và SOF132, cho thấy rằng các yếu tố này thiếu HAP2 (cũng được gọi là protein GCS1) chịu trách nhiệm cho hoạt động xúc tác của nhiều sinh vật nguyên sinh., thực vật và động vật chân đốt.Các protein tổng hợp được thụ tinh 60, 61. Mặc dù có sự tương đồng về cấu trúc mạnh mẽ giữa SPACA6 và IZUMO1, việc loại bỏ các gen mã hóa một trong hai loại protein này đã dẫn đến vô sinh ở chuột đực, cho thấy rằng chức năng của chúng trong phản ứng tổng hợp giao tử không bị trùng lặp..Nói rộng hơn, không có protein tinh trùng nào được biết đến cần thiết cho giai đoạn kết dính của phản ứng tổng hợp là dư thừa.
Vẫn còn một câu hỏi mở về việc liệu SPACA6 (và các thành viên khác của siêu họ IST) có tham gia vào các mối nối giữa các giao tử, hình thành mạng lưới giao tử để tuyển dụng các protein quan trọng vào các điểm hợp nhất hay thậm chí có thể hoạt động như các chất hòa tan khó nắm bắt.Các nghiên cứu về đồng kích thích miễn dịch ở các tế bào HEK293T cho thấy sự tương tác giữa IZUMO1 và SPACA632 có chiều dài đầy đủ.Tuy nhiên, các ectodomain tái tổ hợp của chúng tôi không tương tác trong ống nghiệm, cho thấy rằng các tương tác được thấy trong Noda et al.đều bị xóa trong cấu trúc (lưu ý đuôi tế bào chất của IZUMO1, được chứng minh là không cần thiết cho quá trình thụ tinh62).Ngoài ra, IZUMO1 và/hoặc SPACA6 có thể yêu cầu các môi trường liên kết cụ thể mà chúng tôi không tái tạo trong ống nghiệm, chẳng hạn như cấu trúc đặc trưng về mặt sinh lý hoặc phức hợp phân tử chứa các protein khác (đã biết hoặc chưa được phát hiện).Mặc dù miền ectodomain IZUMO1 được cho là có chức năng điều hòa sự gắn kết của tinh trùng với trứng trong không gian Perivitelline, nhưng mục đích của miền ectodomain SPACA6 vẫn chưa rõ ràng.
Cấu trúc của SPACA6 cho thấy một số bề mặt được bảo tồn có thể liên quan đến tương tác protein-protein.Phần được bảo tồn của vùng bản lề ngay sát mô típ CXXC (được chỉ định là Bản vá 1 ở trên) có một số dư lượng thơm hướng ra bên ngoài thường liên quan đến tương tác kỵ nước và xếp chồng π giữa các phân tử sinh học.Các mặt rộng của miền giống Ig (vùng 2) tạo thành một rãnh tích điện dương với các gốc Arg và His được bảo tồn cao, đồng thời các kháng thể chống lại vùng này trước đây đã được sử dụng để ngăn chặn phản ứng tổng hợp giao tử 30 .Kháng thể này nhận ra epitop tuyến tính 212RIRPAQLTHRGTFS225, có ba trong số sáu gốc arginine và His220 có độ bảo toàn cao.Không rõ liệu rối loạn chức năng là do sự tắc nghẽn của các dư lượng cụ thể này hay do toàn bộ khu vực.Vị trí của khoảng trống này gần đầu C của β-sandwich cho thấy sự tương tác cis với các protein tinh trùng lân cận, nhưng không phải với protein tế bào trứng.Hơn nữa, việc duy trì một đám rối giàu proline có tính linh hoạt cao (vị trí 3) trong bản lề có thể là nơi diễn ra tương tác protein-protein hoặc, nhiều khả năng hơn, cho thấy sự duy trì tính linh hoạt giữa hai miền.Giới tính rất quan trọng đối với vai trò chưa biết của SPACA6.sự kết hợp của giao tử.
SPACA6 có đặc tính của các protein bám dính giữa các tế bào, bao gồm cả bánh mì β giống Ig.Nhiều protein kết dính (ví dụ cadherin, integrins, adhesin và IZUMO1) sở hữu một hoặc nhiều miền β-sandwich giúp mở rộng protein từ màng tế bào đến các mục tiêu môi trường của chúng63,64,65.Miền giống Ig của SPACA6 cũng chứa một mô típ thường thấy trong β-sandwiches có độ bám dính và sự gắn kết: các sợi đôi của các sợi song song ở đầu của β-sandwiches, được gọi là kẹp cơ học66.Người ta tin rằng mô típ này làm tăng khả năng chống lại lực cắt, điều này có giá trị đối với các protein liên quan đến tương tác giữa các tế bào.Tuy nhiên, bất chấp sự tương đồng với chất kết dính này, hiện tại không có bằng chứng nào cho thấy SPACA6 tương tác với lòng trắng trứng.Miền ectodomain SPACA6 không thể liên kết với JUNO và các tế bào HEK293T biểu hiện SPACA6, như được hiển thị ở đây, hầu như không tương tác với các tế bào trứng thiếu zona 32 .Nếu SPACA6 thiết lập liên kết giữa các giao tử, những tương tác này có thể yêu cầu sửa đổi sau dịch mã hoặc ổn định bởi các protein tinh trùng khác.Để hỗ trợ cho giả thuyết thứ hai, tinh trùng thiếu IZUMO1 liên kết với tế bào trứng, chứng minh rằng các phân tử khác ngoài IZUMO1 có liên quan đến bước kết dính giao tử 27 .
Nhiều protein tổng hợp của virus, tế bào và sự phát triển có các đặc tính dự đoán chức năng của chúng là các tác nhân gây bệnh.Ví dụ, các glycoprotein tổng hợp của virus (loại I, II và III) có một peptide hoặc vòng tổng hợp kỵ nước ở cuối protein được đưa vào màng tế bào chủ.Bản đồ tính ưa nước của IZUMO143 và cấu trúc (được xác định và dự đoán) của siêu họ IST cho thấy không có peptide tổng hợp kỵ nước rõ ràng.Do đó, nếu bất kỳ protein nào trong siêu họ IST có chức năng như chất gây nóng chảy, thì chúng hoạt động theo cách khác với các ví dụ đã biết khác.
Tóm lại, chức năng của các thành viên trong siêu họ protein IST liên quan đến phản ứng tổng hợp giao tử vẫn còn là một bí ẩn đầy trêu ngươi.Phân tử tái tổ hợp SPACA6 đặc trưng của chúng tôi và cấu trúc được phân giải của nó sẽ cung cấp cái nhìn sâu sắc về mối quan hệ giữa các cấu trúc chung này và vai trò của chúng trong quá trình gắn và hợp nhất giao tử.
Trình tự DNA tương ứng với miền ectodomain SPACA6 được dự đoán ở người (số gia nhập NCBI NP_001303901.1; dư lượng 27–246) đã được tối ưu hóa bằng codon để biểu hiện trong các tế bào Drosophila melanogaster S2 và được tổng hợp thành một đoạn gen với trình tự mã hóa Kozak (Eurofins Genomics)., tín hiệu bài tiết BiP và các đầu 5′ và 3′ tương ứng để nhân bản gen này không phụ thuộc vào việc thắt dây thành một vec tơ biểu hiện pMT dựa trên chất kích thích metallicothionein được sửa đổi để chọn lọc với puromycin (pMT-puro).Vectơ pMT-puro mã hóa vị trí phân cắt trombin, theo sau là thẻ đầu cuối C 10x-His (Hình S2).
Việc truyền ổn định vectơ pMT-puro SPACA6 vào các tế bào D. melanogaster S2 (Gibco) được thực hiện tương tự như giao thức được sử dụng cho IZUMO1 và JUNO43.Các tế bào S2 được rã đông và phát triển trong môi trường Schneider (Gibco) được bổ sung nồng độ cuối cùng là 10% (v/v) huyết thanh thai nhi bất hoạt do nhiệt (Gibco) và kháng sinh kháng nấm 1X (Gibco).Các ô chuyển qua sớm (3,0 x 106 ô) được đặt vào các giếng riêng lẻ của đĩa 6 giếng (Corning).Sau 24 giờ ủ ở 27°C, các tế bào được thay thế bằng hỗn hợp 2 mg vectơ SPACA6 pMT-puro và thuốc thử chuyển hóa Effectene (Qiagen) theo quy trình của nhà sản xuất.Các tế bào được truyền được ủ trong 72 giờ và sau đó được thu hoạch bằng puromycin 6 mg/ml.Sau đó, các tế bào được phân lập từ môi trường Schneider hoàn chỉnh và đặt vào môi trường Insect-XPRESS (Lonza) không có huyết thanh để sản xuất protein quy mô lớn.Một mẻ nuôi cấy tế bào S2 1 L được tăng lên 8–10 × 106 ml-1 tế bào trong bình Erlenmeyer bằng polypropylen đáy phẳng thông gió 2 L và sau đó khử trùng với nồng độ cuối cùng là 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) và lọc vô trùng.gây ra.Môi trường nuôi cấy cảm ứng được ủ ở 27° C. với tốc độ 120 vòng/phút trong bốn ngày.
Môi trường được điều hòa chứa SPACA6 được phân lập bằng cách ly tâm ở tốc độ 5660×g ở 4°C, sau đó là hệ thống lọc dòng tiếp tuyến Centramate (Pall Corp) với màng MWCO 10 kDa.Cho môi trường đậm đặc chứa SPACA6 vào cột nhựa agarose Ni-NTA (Qiagen) 2 ml.Nhựa Ni-NTA được rửa bằng 10 cột thể tích (CV) dung dịch đệm A và sau đó thêm 1 CV dung dịch đệm A để tạo ra nồng độ imidazole cuối cùng là 50 mM.SPACA6 được rửa giải bằng 10 ml dung dịch đệm A bổ sung imidazole đến nồng độ cuối cùng là 500 mM.Thrombin loại hạn chế (Millipore Sigma) đã được thêm trực tiếp vào ống lọc máu (MWCO 12-14 kDa) ở mức 1 đơn vị mỗi mg SPACA6 so với 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 và 150 mM NaCl (dung dịch đệm B) để lọc máu.) ở 4°C trong 48 giờ.SPACA6 được phân tách bằng huyết khối sau đó được pha loãng ba lần để giảm nồng độ muối và được nạp vào cột trao đổi cation MonoS 5/50 GL (Cytiva/GE) 1 ml đã được cân bằng với 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Bộ trao đổi cation được rửa bằng 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, sau đó SPACA6 được rửa giải với gradient tuyến tính từ 0 đến 500 mm NaCl trong 10 mm Tris-HCl, pH 7,5 cho 25 OK.Sau khi sắc ký trao đổi ion, SPACA6 được cô đặc đến 1 ml và rửa giải đẳng cấp từ cột ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) đã được cân bằng với dung dịch đệm B. Theo sắc ký đồ, các phần gộp và phần cô đặc chứa SPACA6.Độ tinh khiết được kiểm soát bằng điện di nhuộm màu Coomassie trên gel SDS-polyacrylamide 16%.Nồng độ protein được định lượng bằng độ hấp thụ ở bước sóng 280nm sử dụng định luật Beer-Lambert và hệ số tuyệt chủng mol lý thuyết.
SPACA6 tinh khiết được thẩm tách qua đêm với natri photphat 10 mM, pH 7,4 và 150 mM NaF và pha loãng thành 0,16 mg/mL trước khi phân tích bằng phương pháp quang phổ CD.Quá trình quét quang phổ của đĩa CD có bước sóng từ 185 đến 260 nm được thu thập trên máy đo quang phổ Jasco J-1500 sử dụng cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 1 mm (Helma) ở 25°C với tốc độ 50 nm/phút.Phổ CD đã được hiệu chỉnh cơ bản, tính trung bình trên 10 lần thu nhận và được chuyển đổi thành độ elip dư trung bình (θMRE) tính bằng độ cm2/dmol:
trong đó MW là khối lượng phân tử của từng mẫu trong Da;N là số lượng axit amin;θ là độ elip tính bằng mili độ;d tương ứng với chiều dài của đường quang tính bằng cm;nồng độ protein theo đơn vị.