347 12,7 * 1,24mm Ống cuộn bằng thép không gỉ, Cơ chế phân tử ngưng tụ tĩnh điện đồng bộ và kết tụ của α-synuclein và tau

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Ngoài ra, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Thanh trượt hiển thị ba bài viết trên mỗi slide.Sử dụng các nút quay lại và tiếp theo để di chuyển qua các trang chiếu hoặc các nút điều khiển trang chiếu ở cuối để di chuyển qua từng trang chiếu.

Đặc điểm kỹ thuật ống thép không gỉ 347

347 12.7*1.24mm Ống thép không gỉ cuộn

Đường kính ngoài: 6,00 mm OD đến 914,4 mm OD, Kích thước lên tới 24” NB Có sẵn Hàng tồn kho, Kích thước OD Ống thép có sẵn Hàng tồn kho

Phạm vi độ dày ống SS 347: 0,3mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, v.v. (0,5-12mm) Hoặc kích thước không thông thường được điều chỉnh theo yêu cầu

Kiểu: Ống liền mạch SS 347 |Ống SS 347 ERW |Ống hàn SS 347 |Ống chế tạo SS 347 |Ống SS 347 CDW, Ống LSAW / Hàn đường may / Vẽ lại

Mẫu: Ống/Ống tròn SS 347, Ống/Ống vuông SS 347, Ống/Ống hình chữ nhật SS 347, Ống cuộn SS 347, Hình chữ U SS 347, Cuộn bánh Pan Cake SS 347, Ống thủy lực SS 347

Chiều dài: Ngẫu nhiên đơn, Ngẫu nhiên kép & Chiều dài bắt buộc Kết thúc: Đầu trơn, Đầu vát, Có rãnh

Bảo vệ cuối: Mũ nhựa |Hoàn thiện bên ngoài: Hoàn thiện gương 2B, số 4, số 1, số 8 cho ống thép không gỉ, hoàn thiện theo yêu cầu của khách hàng

Điều kiện giao hàng: Được ủ và ngâm, đánh bóng, ủ sáng, rút ​​nguội

Kiểm tra, Báo cáo thử nghiệm: Chứng chỉ thử nghiệm tại nhà máy, EN 10204 3.1, Báo cáo hóa học, Báo cáo cơ học, Báo cáo thử nghiệm PMI, Báo cáo kiểm tra trực quan, Báo cáo kiểm tra của bên thứ ba, Báo cáo phòng thí nghiệm được NABL phê duyệt, Báo cáo thử nghiệm phá hủy, Báo cáo thử nghiệm không phá hủy

Đóng gói: Đóng gói trong hộp gỗ, túi nhựa, dải thép đi kèm hoặc theo yêu cầu của khách hàng

Đặc biệt: Kích thước và thông số kỹ thuật khác ngoài trên có thể được sản xuất theo yêu cầu

Phạm vi kích thước ống SS 347: 1/2 inch NB, OD đến 24 inch

ASTM A312 347: Ống austenit hàn liền mạch và có đường nối thẳng dành cho nhiệt độ cao và dịch vụ ăn mòn nói chung.Kim loại phụ không được phép trong quá trình hàn.

ASTM A358 347: Ống austenit hàn điện dùng cho dịch vụ ăn mòn và/hoặc nhiệt độ cao.Thông thường chỉ có đường ống lên đến 8 inch được sản xuất theo thông số kỹ thuật này.Việc bổ sung kim loại phụ được cho phép trong quá trình hàn.

ASTM A790 347: Ống ferritic/austenit (song công) hàn liền và có đường nối thẳng dành cho dịch vụ ăn mòn nói chung, đặc biệt chú trọng đến khả năng chống nứt ăn mòn do ứng suất.

ASTM A409 347: Ống vách nhẹ austenit đường kính lớn được hàn điện theo đường thẳng hoặc đường xoắn ốc với kích thước từ 14” đến 30” với tường Sch5S và Sch 10S dành cho chất ăn mòn và/hoặc nhiệt độ cao

ASTM A376 347: Ống austenit liền mạch cho các ứng dụng nhiệt độ cao.

ASTM A813 347: Ống austenit hàn đơn, hàn đơn hoặc đôi cho các ứng dụng ăn mòn nói chung và nhiệt độ cao.

ASTM A814 347: Ống austenit hàn gia công nguội cho nhiệt độ cao và dịch vụ ăn mòn thông thường.

Thành phần hóa học của ống thép không gỉ 347H

Tính chất cơ học của ống thép không gỉ 347H

Tính chất vật lý của ống thép không gỉ 347H

Các cấp tương đương cho ống thép không gỉ 347H

Sự kết tụ amyloid alpha-synuclein (αS) là dấu hiệu đặc trưng của bệnh Parkinson và các bệnh lý synuclein khác.Gần đây, protein tau thường liên quan đến bệnh Alzheimer có liên quan đến bệnh lý αS và được phát hiện là cùng định vị trong các thể vùi giàu αS, mặc dù cơ chế phân tử của sự đông tụ của hai protein vẫn chưa rõ ràng.Ở đây chúng tôi báo cáo rằng pha αS tách thành chất ngưng tụ lỏng thông qua quá trình ngưng tụ phức tĩnh điện với các polypeptide tích điện dương như tau.Tùy thuộc vào ái lực của αS đối với các polycation và tốc độ suy giảm hóa trị của mạng lưới đông máu, các cục máu đông trải qua quá trình keo hóa hoặc kết tụ nhanh chóng, sau đó là sự kết tụ amyloid chậm.Bằng cách kết hợp một bộ kỹ thuật lý sinh tiên tiến, chúng tôi có thể mô tả đặc điểm của quá trình phân tách pha αS/Tau lỏng-lỏng và xác định các yếu tố chính dẫn đến sự hình thành các tập hợp không đồng nhất chứa cả hai protein trong chất ngưng tụ protein lỏng.
Ngoài các ngăn màng, sự phân tách không gian trong tế bào cũng có thể đạt được bằng cách hình thành các chất đậm đặc giống chất lỏng, giàu protein gọi là ngưng tụ hoặc giọt phân tử sinh học, thông qua một quá trình được gọi là tách pha lỏng-lỏng (LLPS).Những giọt này được hình thành bởi các tương tác thời gian đa hóa trị, thường là giữa protein hoặc protein và RNA và phục vụ nhiều chức năng khác nhau trong hầu hết các hệ thống sống.Một số lượng lớn các protein có khả năng LLP biểu hiện các chuỗi có độ phức tạp thấp, có tính rối loạn cao về bản chất và trong việc hình thành các chất ngưng tụ phân tử sinh học3,4,5.Nhiều nghiên cứu thực nghiệm đã tiết lộ tính chất linh hoạt, thường bị rối loạn và đa hóa trị của các protein tạo nên các chất ngưng tụ giống như chất lỏng này, mặc dù người ta biết rất ít về các yếu tố quyết định phân tử cụ thể kiểm soát sự tăng trưởng và trưởng thành của các chất ngưng tụ này thành chất rắn hơn. tình trạng..
Dữ liệu mới ủng hộ giả thuyết rằng LLPS điều khiển protein bất thường và sự biến đổi các giọt thành cấu trúc rắn có thể là con đường tế bào có liên quan dẫn đến sự hình thành các tập hợp độc hại không hòa tan thường là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thoái hóa.Nhiều protein bị rối loạn nội tại liên quan đến LLPS (IDP), thường có điện tích cao và linh hoạt, từ lâu đã có liên quan đến thoái hóa thần kinh thông qua quá trình tổng hợp amyloid.Đặc biệt, các chất ngưng tụ IDP phân tử sinh học như FUS7 hoặc TDP-438 hoặc các protein có miền lớn có độ phức tạp thấp như hnRNPA19 đã được chứng minh là già đi thành dạng gel hoặc thậm chí là dạng rắn thông qua một quá trình gọi là hóa lỏng.hợp chất.sang quá trình chuyển pha rắn (LSPT) dưới dạng hàm của thời gian hoặc để đáp ứng với một số sửa đổi sau dịch mã hoặc các đột biến có ý nghĩa về mặt bệnh lý1,7.
Một IDP khác liên quan đến LLPS in vivo là Tau, một protein rối loạn liên quan đến vi ống có sự kết tụ amyloid có liên quan đến bệnh Alzheimer10 nhưng gần đây cũng liên quan đến bệnh Parkinson (PD) và các bệnh lý protein hạt nhân khớp thần kinh khác11, 12, 13 có liên quan.Tau đã được chứng minh là tự phân ly khỏi dung dịch/tế bào chất do tương tác tĩnh điện thuận lợi14, dẫn đến sự hình thành các giọt giàu tau được gọi là chất kết tụ tĩnh điện.Người ta cũng quan sát thấy rằng loại tương tác không đặc hiệu này là động lực đằng sau nhiều trạng thái ngưng tụ phân tử sinh học trong tự nhiên15.Trong trường hợp protein tau, sự kết tụ tĩnh điện có thể được hình thành bằng cách kết tụ đơn giản, trong đó các vùng tích điện trái dấu của protein sẽ kích hoạt quá trình phân tách hoặc bằng cách kết tụ phức tạp thông qua tương tác với các polyme tích điện âm như RNA.
Gần đây, α-synuclein (αS), một IDP amyloid có liên quan đến PD và các bệnh thoái hóa thần kinh khác được gọi chung là bệnh synucleinopathy17,18, đã được chứng minh trong các mô hình tế bào và động vật19,20 tập trung ở các chất ngưng tụ protein có hành vi giống như chất lỏng.Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng αS trải qua LLPS bằng cách tổng hợp đơn giản thông qua các tương tác kỵ nước chủ yếu, mặc dù quá trình này đòi hỏi nồng độ protein đặc biệt cao và thời gian ủ dài không điển hình19,21.Liệu các chất ngưng tụ có chứa αS được quan sát in vivo được hình thành bởi quá trình này hay quá trình LLPS khác vẫn là một vấn đề chính chưa được giải quyết.Tương tự như vậy, mặc dù sự kết tụ amyloid αS đã được quan sát thấy ở các tế bào thần kinh ở PD và các bệnh lý synucleinopathies khác, cơ chế chính xác mà αS trải qua quá trình tổng hợp amyloid nội bào vẫn chưa rõ ràng, vì sự biểu hiện quá mức của protein này dường như không tự kích hoạt quá trình này.Thường cần phải có thêm tổn thương tế bào, điều này cho thấy rằng cần có một số vị trí tế bào hoặc môi trường vi mô nhất định để tái tạo các tổ hợp amyloid αS nội bào.Một môi trường tế bào đặc biệt dễ bị kết tụ có thể là bên trong các chất ngưng tụ protein23 .
Điều thú vị là, αS và tau đã được phát hiện là cùng định vị trong các thể vùi bệnh đặc trưng ở người mắc bệnh Parkinson và các bệnh lý synucleinopathies khác24,25 và các thí nghiệm đã báo cáo mối quan hệ bệnh lý hiệp đồng giữa hai protein26,27 cho thấy mối quan hệ tiềm năng giữa tập hợp αS và tau trong các bệnh thoái hóa thần kinh.sự ốm yếu.αS và tau đã được phát hiện là có tương tác và thúc đẩy sự kết tụ của nhau trong ống nghiệm và in vivo 28,29 và các tập hợp không đồng nhất bao gồm hai loại protein này đã được quan sát thấy trong não của những bệnh nhân mắc bệnh synucleinopathies30.Tuy nhiên, người ta biết rất ít về cơ sở phân tử của sự tương tác giữa αS và tau cũng như cơ chế kết hợp của nó.αS đã được báo cáo là tương tác với tau thông qua lực hút tĩnh điện giữa vùng đầu C tích điện âm cao của αS và vùng giàu proline trung tâm của tau, vùng này cũng được làm giàu với các dư lượng tích điện dương.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ ra rằng αS thực sự có thể phân ly thành các giọt thông qua quá trình ngưng tụ phức tĩnh điện với sự có mặt của protein tau, trái ngược với sự tương tác của nó với các polypeptide tích điện dương khác như poly-L-lysine (pLK) và trong quá trình này .αS hoạt động như một phân tử giàn giáo cho mạng lưới giọt nước.Chúng tôi đã xác định được những khác biệt đáng chú ý trong quá trình trưởng thành của các chất đồng tụ αS tĩnh điện, có liên quan đến sự khác biệt về hóa trị và cường độ tương tác của các protein liên quan đến mạng lưới đồng tụ.Thật thú vị, chúng tôi đã quan sát thấy sự đồng tổng hợp của các protein amyloid αS và tau trong các chất đông tụ chất lỏng tồn tại lâu dài và xác định được một số yếu tố chính dẫn đến sự kết tụ của hai loại protein này trong các chất đông tụ chất lỏng như vậy.Ở đây chúng tôi mô tả chi tiết quá trình này, đây là một cơ chế phân tử có thể làm cơ sở cho sự tập trung của hai protein trong các thể vùi đặc hiệu của bệnh.
αS có đuôi C có tính anion cao ở pH trung tính (Hình 1a) và chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng nó có thể trải qua LLPS thông qua quá trình ngưng tụ các phức tĩnh điện với các phân tử polypeptide bị rối loạn đa cation.Chúng tôi đã sử dụng poly-L-lysine (pLK) dư 100 làm phân tử mô hình ban đầu do tính chất polyme bị rối loạn và tích điện dương ở độ pH trung tính là 32. Đầu tiên, chúng tôi xác nhận rằng pLK tương tác với miền Ct của αS thông qua quang phổ Giải pháp NMR (Hình 1b) sử dụng αS được gắn nhãn 13C/15N với tỷ lệ mol αS:pLK ngày càng tăng.Sự tương tác của pLK với miền Ct của αS biểu hiện ở sự nhiễu loạn của sự dịch chuyển hóa học và sự giảm cường độ cực đại ở vùng protein này.Điều thú vị là khi chúng tôi trộn αS với pLK ở nồng độ αS xấp xỉ.5–25 µM với sự có mặt của polyethylene glycol (5–15% PEG-8) (dung dịch đệm LLPS điển hình: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8), chúng tôi ngay lập tức trải qua một lĩnh vực hình thành protein rộng lớn .các giọt được quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang (WF) và kính hiển vi trường sáng (BF) (Hình 1c).Các giọt 1-5 µm chứa αS đậm đặc (thêm 1 µM αS được gắn nhãn AlexaFluor488, AF488-αS), đặc tính tĩnh điện của chúng có thể bắt nguồn từ khả năng chống lại 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) và độ nhạy của nó với sự gia tăng nồng độ NaCl (Hình 1c).Bản chất giống như chất lỏng của các chất kết tủa của phức tĩnh điện αS / pLK được thể hiện bằng khả năng hợp nhất của chúng trong vòng một phần nghìn giây (Hình 1d).Sử dụng phép đo độ đục, chúng tôi đã định lượng sự hình thành các giọt trong các điều kiện này, xác nhận tính chất tĩnh điện của tương tác chính liên quan đến độ ổn định của nó (Hình 1e) và đánh giá ảnh hưởng của các tỷ lệ polymer khác nhau đến quy trình LLPS (Hình 1f).Mặc dù sự hình thành giọt nước được quan sát thấy ở nhiều tỷ lệ polymer khác nhau, quá trình này rất thuận lợi khi pLK vượt quá αS.LLP cũng đã được quan sát bằng cách sử dụng chất thay thế khác nhau về mặt hóa học dextran-70 (70 kDa) hoặc sử dụng nhiều dạng mẫu khác nhau, bao gồm giọt thủy tinh, giếng vi tấm bằng nhiều vật liệu khác nhau, Eppendorf hoặc mao quản thạch anh.
Sơ đồ biểu diễn các vùng protein khác nhau trong các biến thể WT-αS và ΔCt-αS được sử dụng trong nghiên cứu này.Miền đầu N lưỡng tính, vùng hình thành amyloid kỵ nước (NAC) và miền đầu C tích điện âm lần lượt được hiển thị bằng màu xanh lam, cam và đỏ.Bản đồ Phí ròng trên mỗi phần dư (NCPR) của WT-αS được hiển thị.b Phân tích NMR về tương tác αS/pLK trong trường hợp không có các cụm đại phân tử.Khi nồng độ pLK tăng lên (tỷ lệ mol αS:pLK lần lượt là 1:0,5, 1:1,5 và 1:10 được hiển thị bằng màu xanh lục nhạt, xanh lục và xanh đậm).c Coacervate αS/pLK (tỷ lệ mol 1:10) ở 25 µM (1 µM αS được gắn nhãn AF488 hoặc pLK được gắn nhãn Atto647N cho hình ảnh WF) trong bộ đệm LLPS (trên cùng) hoặc được bổ sung 500 mM NaCl (phía dưới bên trái) hoặc sau 10 % 1,6-hexanediol (1,6-HD; phía dưới bên phải).Thanh tỷ lệ = 20 µm.d Hình ảnh hiển vi đại diện của phản ứng tổng hợp giọt BF của αS/pLK (tỷ lệ mol 1:10) ở nồng độ 25 μM;mũi tên biểu thị sự hợp nhất của từng giọt (mũi tên màu đỏ và màu vàng) thành một giọt mới (mũi tên màu cam) trong vòng 200 mili giây).Thanh tỷ lệ = 20 µm.e Sự tán xạ ánh sáng (ở bước sóng 350 nm) tập hợp αS/pLK trong bộ đệm LLPS trước và sau khi thêm 500 mM NaCl hoặc 10% 1,6-HD ở 25 µM αS (N = 3 mẫu lặp lại, giá trị trung bình và độ lệch chuẩn cũng được chỉ ra).f Hình ảnh BF (trên cùng) và phân tích tán xạ ánh sáng (ở bước sóng 350nm, dưới cùng) của tập hợp αS / pLK ở 25 μM αS với tỷ lệ mol αS: pLK tăng dần (N = 3 lần lặp mẫu, độ lệch trung bình và độ lệch chuẩn cũng được chỉ định).Thanh tỷ lệ = 10 Pha.Thanh tỷ lệ trên một hình ảnh cho biết tỷ lệ của tất cả hình ảnh trong một bảng.Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Dựa trên những quan sát của chúng tôi về sự ngưng tụ phức tĩnh điện αS/pLK và những quan sát trước đây về αS như một phân tử khách hàng của ngưng tụ tau/RNA thông qua tương tác trực tiếp với tau31, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng αS và tau có thể cùng phân ly với dung môi khi không có RNA sự ngưng tụ.thông qua các phức hợp tĩnh điện, và αS là protein khung trong các chất cô đặc αS/Tau (xem phân bố điện tích tau trong Hình 2e).Chúng tôi quan sát thấy rằng khi 10 μM αS và 10 μM Tau441 (chứa lần lượt 1 μM AF488-αS và 1 μM Atto647N-Tau) được trộn với nhau trong bộ đệm LLPS, chúng dễ dàng tạo thành các tập hợp protein chứa cả hai loại protein, như được thấy dưới kính hiển vi WF.(Hình 2a).Sự tập trung của hai protein trong các giọt được xác nhận bằng kính hiển vi đồng tiêu (CF) (Hình bổ sung. 1a).Hành vi tương tự đã được quan sát thấy khi dextran-70 được sử dụng làm tác nhân tổng hợp (Hình bổ sung. 1c).Sử dụng PEG hoặc dextran được dán nhãn FITC, chúng tôi thấy rằng cả hai tác nhân gây đông đều được phân bố đồng đều trên các mẫu, không cho thấy sự phân biệt hay liên kết (Hình bổ sung. 1d).Đúng hơn, nó gợi ý rằng trong hệ thống này, chúng thúc đẩy sự phân tách pha thông qua các hiệu ứng đông tụ phân tử, vì PEG là tác nhân đông tụ ổn định ưu tiên, như đã thấy trong các hệ thống LLP khác33,34.Những giọt giàu protein này nhạy cảm với NaCl (1 M) nhưng không nhạy với 1,6-HD (10% v/v), xác nhận đặc tính tĩnh điện của chúng (Hình bổ sung 2a, b).Hành vi chất lỏng của chúng được xác nhận bằng cách quan sát các sự kiện giọt hợp nhất trong một phần nghìn giây bằng kính hiển vi BF (Hình 2b).
hình ảnh kính hiển vi Đồng tiêu (CF) của các chất kết tụ αS/Tau441 trong bộ đệm LLPS (10 μM mỗi protein, 0,5 μM αS được gắn nhãn AF488 và Tau441 được gắn nhãn Atto647N).b Hình ảnh tương phản giao thoa vi sai (DIC) đại diện của các sự kiện phản ứng tổng hợp giọt αS/Tau441 (10 μM cho mỗi protein).c Sơ đồ pha dựa trên sự tán xạ ánh sáng (ở bước sóng 350 nm) của Tau441 LLPS (0–15 µM) khi không có (trái) hoặc có (phải) 50 µM αS.Màu sắc ấm hơn cho thấy sự tán xạ nhiều hơn.d Sự tán xạ ánh sáng của các mẫu LLPS αS/Tau441 với nồng độ αS ngày càng tăng (Tau441 ở mức 5 µM, N = 2–3 lần lặp lại mẫu như đã chỉ ra).e Trình bày sơ đồ của một số biến thể protein tau và các vùng khác nhau của protein được sử dụng trong nghiên cứu này: miền đầu N tích điện âm (màu đỏ), vùng giàu proline (màu xanh), miền liên kết vi ống (MTBD, được đánh dấu màu cam) và cặp xoắn ốc hình thành amyloid.vùng dây tóc (PHF) nằm trong MTBD (màu xám).Bản đồ Phí ròng trên mỗi dư lượng (NCPR) của Tau441 được hiển thị.f Sử dụng 1 αS có nhãn AF488 và ΔNt- có nhãn Atto647N, sử dụng 1 µM αS hoặc ΔCt-αS có nhãn AF488 với sự có mặt của ΔNt-Tau (trên cùng, 10 µM mỗi protein) hoặc K18 (dưới cùng, 50 µM mỗi protein ) ) ) ảnh vi mô của WF ngưng tụ trong đệm LLPS hoặc K18.Các thanh tỷ lệ trong một hình ảnh biểu thị tỷ lệ của tất cả các hình ảnh trong một bảng (20 Pha cho các bảng a, b và f).Dữ liệu thô cho bảng c và d được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Để kiểm tra vai trò của αS trong quy trình LLPS này, trước tiên chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của αS đến độ ổn định của giọt nước bằng phương pháp đo thận bằng cách tăng nồng độ NaCl (Hình 2c).Nồng độ muối trong các mẫu chứa αS càng cao thì giá trị tán xạ ánh sáng (ở bước sóng 350 nm) càng cao, điều này cho thấy vai trò ổn định của αS trong hệ thống LLPS này.Có thể quan sát thấy hiệu ứng tương tự bằng cách tăng nồng độ αS (và do đó tăng tỷ lệ αS:Tau441) lên khoảng.Tăng gấp 10 lần so với nồng độ tau (5 µM) (Hình 2d).Để chứng minh rằng αS là một protein khung trong coacervates, chúng tôi quyết định nghiên cứu hành vi của đột biến Tau bị gián đoạn LLPS, thiếu vùng đầu N tích điện âm (dư lượng 1–150, xem Hình 2e) được gọi là ΔNt-Tau.Kính hiển vi WF và phép đo thận đã xác nhận rằng bản thân ΔNt-Tau không trải qua LLPS (Hình 2f và Hình bổ sung 2d), như đã báo cáo trước đó 14. Tuy nhiên, khi αS được thêm vào dung dịch phân tán của biến thể Tau bị cắt cụt này, quy trình LLPS đã hoàn toàn bị hủy bỏ. được khôi phục với mật độ giọt gần với mật độ giọt của dung dịch Tau và αS kích thước đầy đủ trong các điều kiện và nồng độ protein tương tự.Quá trình này cũng có thể được quan sát trong điều kiện mật độ đông phân tử thấp (Hình bổ sung. 2c).Vai trò của vùng αS ở đầu C, nhưng không phải toàn bộ chiều dài của nó, trong quy trình LLPS được thể hiện bằng cách ức chế sự hình thành giọt nước bằng cách sử dụng biến thể αS bị cắt cụt ở đầu C thiếu dư lượng 104–140 (Hình 1a) của (ΔCt- αS) (Hình 2f và Hình bổ sung 2d).Sự tập trung của αS và ΔNt-Tau đã được xác nhận bằng kính hiển vi huỳnh quang đồng tiêu (Hình bổ sung. 1b).
Để thử nghiệm thêm cơ chế LLPS giữa Tau441 và αS, một biến thể Tau bổ sung đã được sử dụng, cụ thể là đoạn lõi sợi xoắn ốc theo cặp (PHF) trong miền liên kết vi ống (MTBD), nếu nó chứa bốn miền lặp lại đặc trưng, ​​thường còn được gọi là là đoạn K18 (xem hình 2e).Gần đây đã có báo cáo rằng αS ưu tiên liên kết với protein tau nằm trong miền giàu proline theo trình tự đứng trước miền liên kết với vi ống.Tuy nhiên, vùng PHF cũng giàu dư lượng tích điện dương (xem Hình 2e), đặc biệt là lysine (15% dư lượng), điều này khiến chúng tôi phải kiểm tra xem vùng này có góp phần vào sự ngưng tụ của phức hợp αS/Tau hay không.Chúng tôi quan sát thấy rằng chỉ riêng K18 không thể kích hoạt LLPS ở nồng độ lên tới 100 μM trong các điều kiện được thử nghiệm (đệm LLPS với 15% PEG hoặc 20% dextran) (Hình 2f).Tuy nhiên, khi chúng tôi thêm 50 µM αS vào 50 µM K18, sự hình thành nhanh chóng của các giọt protein chứa K18 và αS đã được quan sát bằng phương pháp đo thận (Hình bổ sung 2d) và kính hiển vi WF (Hình 2f).Đúng như dự đoán, ΔCt-αS không thể khôi phục hoạt động LLPS của K18 (Hình 2f).Chúng tôi lưu ý rằng quá trình tổng hợp αS/K18 yêu cầu nồng độ protein cao hơn một chút để tạo ra LLPS so với αS/ΔNt-Tau hoặc αS/Tau441, các yếu tố khác không đổi.Điều này nhất quán với sự tương tác mạnh mẽ hơn của vùng đầu tận cùng αS C với miền Tau giàu proline so với miền liên kết với vi ống, như được mô tả trước đây 31 .
Do ΔNt-Tau không thể thực hiện LLPS khi không có αS, chúng tôi đã chọn biến thể Tau này làm mô hình để mô tả đặc điểm của αS/Tau LLPS do tính đơn giản của nó trong các hệ thống LLPS có Tau có chiều dài đầy đủ (isotype, Tau441/Tau441).với các quy trình tổng hợp phức tạp (dị hình, αS/Tau441).Chúng tôi đã so sánh mức độ kết tụ của αS (như một phần của protein pha cô đặc, fαS,c) trong các hệ thống αS/Tau và αS/ΔNt-Tau bằng cách ly tâm và phân tích SDS-PAGE pha phân tán (xem 2e), nhận thấy các giá trị rất giống nhau ​​cho tất cả các protein ở cùng nồng độ.Đặc biệt, chúng tôi thu được fαS,c 84 ± 2% và 79 ± 7% đối với αS/Tau và αS/ΔNt-Tau, tương ứng, cho thấy rằng tương tác dị hình giữa αS và tau là vượt trội so với tương tác giữa các phân tử tau.giữa.
Sự tương tác với các polycation khác nhau và ảnh hưởng của quá trình ngưng tụ đến động học của αS lần đầu tiên được nghiên cứu bằng phương pháp phục hồi huỳnh quang sau phương pháp tẩy trắng (FRAP).Chúng tôi đã thử nghiệm các chất đồng tụ αS/ΔNt-Tau và αS/pLK (100 μM αS được bổ sung 2 μM αS AF488-αS và 100 μM Tau441 hoặc ΔNt-Tau hoặc 1 mM pLK).Dữ liệu thu được trong vòng 30 phút đầu tiên sau khi trộn các thành phần mẫu.Từ các hình ảnh FRAP đại diện (Hình 3a, ngưng tụ αS/Tau441) và các đường cong tiến trình thời gian tương ứng của chúng (Hình 3b, Hình bổ sung 3), có thể thấy rằng động học của αS rất giống với động học của các chất đồng tụ Tau441.và ΔNt-Tau, nhanh hơn nhiều với pLK.Các hệ số khuếch tán được tính toán cho αS bên trong tụ chất theo FRAP (như được mô tả bởi Kang và cộng sự 35) là D = 0,013 ± 0,009 µm2/s và D = 0,026 ± 0,008 µm2/s đối với αS/Tau441 và αS/ΔNt- đối với hệ thống αS/.pLK, Tau và D tương ứng = 0,18 ± 0,04 µm2/s (Hình 3c).Tuy nhiên, hệ số khuếch tán αS trong pha phân tán cao hơn nhiều bậc so với tất cả các pha ngưng tụ, như được xác định bằng Quang phổ tương quan huỳnh quang (FCS, xem Hình bổ sung 3) trong cùng điều kiện (bộ đệm LLPS) nhưng không có polycation ( D = 8 ± 4 µm2/s).Do đó, động học của quá trình dịch mã αS giảm đáng kể ở các chất đông tụ so với protein trong pha phân tán do hiệu ứng đông tụ phân tử rõ rệt, mặc dù tất cả các chất đông tụ vẫn giữ được các đặc tính giống như chất lỏng trong nửa giờ đầu sau khi hình thành, trái ngược với pha tau.động học nhanh hơn trong ngưng tụ pLK.
a–c phân tích FRAP về động lực học αS (2% αS được gắn nhãn AF488) trong các chất đồng tụ tĩnh điện.Hình ảnh đại diện của các xét nghiệm αS/Tau441 FRAP ba lần được hiển thị trong (a), trong đó các vòng tròn màu đỏ biểu thị các khu vực bị mất màu.Thanh tỷ lệ là 5 µm.b Đường cong FRAP trung bình và (c) hệ số khuếch tán được tính toán (D) cho 5–6 (N) giọt khác nhau từ ba thí nghiệm sử dụng 100 µM αS và nồng độ cân bằng mol của Tau441 (màu đỏ) hoặc ΔNt-Tau (màu xanh) hoặc pLK (màu xanh lá cây) gấp 10 lần nồng độ LLPS.Độ lệch chuẩn của đường cong FRAP được thể hiện bằng màu bóng mờ.Để so sánh, hệ số khuếch tán αS trong pha phân tán được xác định ba lần bằng phương pháp quang phổ tương quan huỳnh quang (FCS) (xem Hình 3 bổ sung và các phương pháp để biết thêm thông tin).d Phổ EPR dải X liên tục 100 μM TEMPOL-122-αS trong bộ đệm LLPS không có bất kỳ polycation nào (màu đen) hoặc với sự hiện diện của 100 μM Tau441 (màu đỏ) hoặc ΔNt-Tau (màu xanh) hoặc 1 mM pLK (màu xanh lá cây).Hình nhỏ hiển thị chế độ xem phóng to của các đường trường mạnh nơi xảy ra những thay đổi mạnh mẽ nhất.e Đường cong liên kết 50 μM TEMPOL-122-αS với nhiều polycation khác nhau khi không có LLPS (không có PEG).Biên độ giảm của dải III so với dải II (IIII/III) của phổ EPR chuẩn hóa cho thấy làm tăng tỷ lệ mol của Tau441 (màu đỏ), ΔNt-Tau (màu xanh) và pLK (màu xanh lá cây).Các đường màu hiển thị phù hợp với dữ liệu bằng cách sử dụng mô hình liên kết thô với n vị trí liên kết độc lập và giống hệt nhau trên mỗi đường cong.Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Để bổ sung, chúng tôi đã nghiên cứu động lực học của αS trong các đồng bảo tồn khác nhau bằng cách sử dụng nhãn spin có hướng (SDSL) và cộng hưởng thuận từ điện tử liên tục (CW-EPR).Phương pháp này đã được chứng minh là rất hữu ích trong việc báo cáo tính linh hoạt và động lực của IDP với độ phân giải dư thực tế36,37,38.Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã tạo ra dư lượng cystein trong các đột biến Cys đơn lẻ và sử dụng đầu dò quay 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Các dẫn xuất Maleimide dán nhãn cho chúng.Cụ thể hơn, chúng tôi đã chèn các đầu dò TEMPOL ở vị trí 122 hoặc 24 αS (TEMPOL-122-αS và TEMPOL-24-αS).Trong trường hợp đầu tiên, chúng tôi nhắm mục tiêu vào vùng đầu C của protein, vùng này có liên quan đến sự tương tác với các polycation.Thay vào đó, vị trí 24 có thể cung cấp cho chúng ta thông tin về động lực tổng thể của protein trong chất ngưng tụ.Trong cả hai trường hợp, tín hiệu EPR thu được đối với protein ở pha phân tán tương ứng với các gốc nitroxide ở trạng thái chuyển động nhanh.Sau khi tách pha với sự có mặt của tau hoặc pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 hoặc ΔNt-Tau theo tỷ lệ 1:1 hoặc pLK theo tỷ lệ 1:10), sự gia tăng cường độ đỉnh tương đối được quan sát thấy ở phổ EPR của αS.Đường tổn thất mở rộng, biểu thị động học tái định hướng αS giảm trong các giọt so với protein ở pha loãng (Hình 3d, Hình bổ sung 4a).Những thay đổi này rõ rệt hơn ở vị trí 122. Trong khi ở vị trí 24, sự hiện diện của pLK không ảnh hưởng đến động học của đầu dò, thì ở vị trí 122, hình dạng vạch phổ thay đổi đáng kể (Hình bổ sung 4a).Khi chúng tôi cố gắng mô hình hóa phổ ở vị trí 122 của hai hệ thống αS / polycation bằng mô hình đẳng hướng (Hình bổ sung 5a) thường được sử dụng để mô tả động lực học của IDP38,39 được gắn nhãn spin, chúng tôi không thể tái tạo lại phổ thực nghiệm..Mô phỏng quang phổ vị trí của 24 vòng quay tương phản (Hình bổ sung 5a).Điều này cho thấy rằng có những vị trí ưu tiên trong không gian cấu hình spin của vùng đầu C của αS khi có sự hiện diện của các polycation.Khi xem xét tỷ lệ αS trong pha ngưng tụ trong các điều kiện EPR thử nghiệm (lần lượt là 84 ± 2%, 79 ± 7% và 47 ± 4% đối với αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau và αS/pLK—xem phần Bổ sung Hình 2e của phân tích dữ liệu c), có thể thấy rằng độ mở rộng được phát hiện bằng phương pháp EPR chủ yếu phản ánh sự tương tác giữa vùng đầu C của αS với các polycation khác nhau trong pha ngưng tụ (thay đổi chính khi sử dụng TEMPOL-122- αS), chứ không phải sự ngưng tụ protein.Sự gia tăng độ nhớt vi mô được quan sát thấy trong đầu dò.Đúng như dự đoán, phổ EPR của protein trong các điều kiện không phải LLPS đã được khôi phục hoàn toàn khi thêm NaCl 1 M vào hỗn hợp (Hình bổ sung 4b).Nhìn chung, dữ liệu của chúng tôi cho thấy những thay đổi được CW-EPR phát hiện chủ yếu phản ánh sự tương tác giữa vùng đầu C của αS với các polycation khác nhau trong pha ngưng tụ và sự tương tác này dường như mạnh hơn với pLK so với Tau.
Để có thêm thông tin cấu trúc về protein trong coacervate, chúng tôi quyết định nghiên cứu hệ thống LLPS sử dụng NMR trong dung dịch.Tuy nhiên, chúng tôi chỉ có thể phát hiện phần αS còn lại trong pha phân tán, điều này có thể là do động lực học của protein bên trong coacervate và pha đậm đặc ở đáy dung dịch trong phân tích NMR giảm.Khi chúng tôi phân tích cấu trúc và động lực học của protein còn lại trong pha phân tán của mẫu LLPS bằng NMR (Hình bổ sung 5c, d), chúng tôi nhận thấy rằng protein hoạt động gần như giống hệt nhau khi có sự hiện diện của pLK và ΔNt-Tau, cả hai đều nằm trong cấu trúc thứ cấp và động lực học của khung protein, được tiết lộ qua các thí nghiệm về sự dịch chuyển hóa học thứ cấp và sự hồi phục R1ρ.Dữ liệu NMR cho thấy đầu C của αS bị mất đáng kể tính linh hoạt về hình dạng trong khi vẫn giữ được tính chất rối loạn của nó, giống như phần còn lại của chuỗi protein, do tương tác của nó với các polycation.
Do sự mở rộng tín hiệu CW-EPR được quan sát thấy trong pha ngưng tụ TEMPOL-122-αS phản ánh sự tương tác của protein với các polycation, nên chúng tôi đã thực hiện chuẩn độ EPR để đánh giá ái lực liên kết của αS với các polycation khác nhau khi không có LLPS (không tích lũy Buffer LLPS), gợi ý rằng các tương tác là như nhau ở pha loãng và pha đậm đặc (được xác nhận bởi dữ liệu của chúng tôi, Hình bổ sung 4a và Hình bổ sung 6).Mục đích là để xem liệu tất cả các chất đông tụ, mặc dù có đặc tính chung giống chất lỏng, có biểu hiện bất kỳ hành vi khác biệt cơ bản nào ở cấp độ phân tử hay không.Đúng như dự đoán, phổ EPR mở rộng khi tăng nồng độ polycation, phản ánh sự giảm tính linh hoạt phân tử do tương tác phân tử của tất cả các đối tác tương tác gần như bão hòa (Hình 3e, Hình bổ sung 6).pLK đạt được độ bão hòa này ở tỷ lệ mol (polycation:αS) thấp hơn so với ΔNt-Tau và Tau441.Trên thực tế, việc so sánh dữ liệu với mô hình liên kết gần đúng giả định n vị trí liên kết độc lập và giống hệt nhau cho thấy hằng số phân ly biểu kiến ​​của pLK (~5 μM) thấp hơn một bậc so với Tau441 hoặc ΔNt-Tau (~50 μM) ).µM).Mặc dù đây chỉ là ước tính sơ bộ, nhưng điều này cho thấy rằng αS có ái lực cao hơn đối với các polycation đơn giản hơn với các vùng điện tích dương liên tục.Do sự khác biệt về ái lực giữa αS và các polycation khác nhau, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng tính chất lỏng của chúng có thể thay đổi khác nhau theo thời gian và do đó phải chịu các quá trình LSPT khác nhau.
Với môi trường rất đông đúc bên trong chất cô đặc protein và bản chất amyloid của protein, chúng tôi đã quan sát hành vi của chất cô đặc theo thời gian để phát hiện các quá trình LSPT có thể xảy ra.Bằng cách sử dụng kính hiển vi BF và CF (Hình 4), chúng tôi đã quan sát thấy αS/Tau441 kết tụ ở mức độ lớn trong dung dịch, tạo thành các giọt lớn tiếp xúc và làm ướt bề mặt đáy giếng/trượt thành những giọt đầy đủ, như mong đợi (Hình bổ sung .7d);chúng tôi gọi những cấu trúc hình thành từ đáy này là “bè protein”.Các cấu trúc này vẫn ở trạng thái lỏng vì chúng vẫn giữ được khả năng hợp nhất (Hình bổ sung 7b) và có thể được nhìn thấy trong vài giờ sau khi LLPS được kích hoạt (Hình 4 và Hình bổ sung 7c).Chúng tôi quan sát thấy rằng quá trình làm ướt được ưa chuộng trên bề mặt vật liệu ưa nước hơn là kỵ nước (Hình bổ sung 7a), như mong đợi đối với các chất kết tủa tĩnh điện có điện tích không cân bằng và do đó tiềm năng bề mặt tĩnh điện cao.Đáng chú ý là sự kết tụ và đi bè của αS/ΔNt-Tau đã giảm đáng kể, trong khi các chất ngưng tụ αS/pLK đã giảm đáng kể (Hình 4).Trong thời gian ủ ngắn, các giọt αS/pLK có thể kết tụ lại và làm ướt bề mặt ưa nước, nhưng quá trình này nhanh chóng dừng lại và sau 5 giờ ủ, chỉ quan sát thấy sự kiện kết tụ hạn chế và không quan sát thấy hiện tượng làm ướt.– chuyển tiếp gel-nhỏ giọt.
BF đại diện (bảng thang độ xám) và CF (bảng bên phải, αS được gắn nhãn AF488 màu xanh lá cây) của các mẫu coacervate chứa 100 µM αS (nhãn huỳnh quang 1%) trong bộ đệm LLPS với sự hiện diện của 100 µM Tau441 (trên cùng) huỳnh quang) hình ảnh hiển vi ΔNt -Tau (giữa) hoặc 1 mM pLK (đáy) tại các thời điểm ủ và tiêu cự khác nhau (z, khoảng cách từ đáy giếng đĩa).Các thí nghiệm được lặp lại 4-6 lần độc lập với nhau và cho kết quả như nhau.Các tụ tụ αS/Tau441 bị ướt sau 24 giờ, tạo thành các mảng lớn hơn hình ảnh.Thanh tỷ lệ cho tất cả hình ảnh là 20 µm.
Sau đó, chúng tôi hỏi liệu các nhóm protein lớn giống như chất lỏng được hình thành trong αS/Tau441 LLPS có dẫn đến sự kết tụ amyloid của bất kỳ protein nào được nghiên cứu hay không.Chúng tôi đã theo dõi quá trình trưởng thành của các giọt αS/Tau441 theo thời gian bằng kính hiển vi WF trong cùng điều kiện như trên, nhưng sử dụng αS có nhãn AF488 và Tau441 có nhãn Atto647N (Hình 5a).Đúng như dự đoán, chúng tôi đã quan sát thấy quá trình định vị protein hoàn chỉnh trong suốt quá trình trưởng thành.Điều thú vị là từ ca.Sau 5 giờ, các cấu trúc không tròn mạnh hơn đã được quan sát bên trong bè, mà chúng tôi gọi là “điểm”, một số trong đó được tập trung hóa bằng αS và một số được làm giàu trong Tau441 (Hình 5a, mũi tên trắng).Những điểm này luôn được quan sát thấy trong các bè ở mức độ lớn hơn đối với αS/ΔNt-Tau so với αS/ΔNt-Tau.Không có điểm khác biệt nào trong các giọt của hệ thống pLK và Tau không có khả năng kết hợp/làm ướt.Để kiểm tra xem các vết bẩn chứa αS và Tau441 này có phải là các chất tổng hợp giống amyloid hay không, chúng tôi đã thực hiện một thí nghiệm tương tự bằng cách sử dụng kính hiển vi CF trong đó Tau441 được dán nhãn Atto647N và thioflavin-T (ThT) đặc hiệu amyloid 12,5 μM đã được thêm vào ngay từ đầu.thuốc nhuộm.Mặc dù không quan sát thấy sự nhuộm màu ThT của các giọt hoặc bè αS/Tau441 ngay cả sau 24 giờ ủ (Hình 5b, hàng trên cùng—các giọt còn lại trên bè protein), các cấu trúc dương tính với ThT chứa Atto647N-Tau441 bên trong bè rất yếu.điều này sao chép kích thước, hình dạng và vị trí của các điểm được mô tả trước đó (Hình 5b, hàng giữa và hàng dưới cùng), cho thấy rằng các điểm này có thể tương ứng với các tập hợp giống amyloid được hình thành trong chất lỏng đông tụ lão hóa.
WF 25 μM αS ở các thời gian ủ và tiêu cự khác nhau (z, khoảng cách từ đáy không được gắn kết) với sự có mặt của 25 μM Tau441 (αS được gắn nhãn 1 μM AF488 và Tau441 được gắn nhãn Atto647N) trong giếng của tấm kính hiển vi có đệm LLPS) .Sáu thí nghiệm được lặp lại độc lập với kết quả tương tự.b Hình ảnh hiển vi CF của 25 μM αS với sự có mặt của 25 μM Tau441 (1 μM Tau441 được gắn nhãn Atto647N) và 12,5 μM thioflavin-T (ThT).Các giọt protein có trọng lượng và các bè và điểm protein lắng đọng lần lượt được hiển thị ở hàng trên cùng và giữa.Hàng dưới cùng hiển thị hình ảnh bè và giọt nước từ 3 lần lặp lại độc lập.Mũi tên trắng biểu thị các chấm dương ThT trong cả hai bảng.Thanh tỷ lệ cho tất cả hình ảnh là 20 µm.
Để kiểm tra chi tiết hơn những thay đổi trong mạng lưới protein coacervate trong quá trình chuyển từ dạng lỏng sang dạng rắn, chúng tôi đã sử dụng hình ảnh vòng đời huỳnh quang (FLIM) và kính hiển vi truyền năng lượng cộng hưởng Forster (FRET) (Hình 6 và Hình bổ sung 8 và 9).Chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng sự trưởng thành đông tụ của lớp thành cấu trúc protein tổng hợp cô đặc hơn hoặc thậm chí giống rắn hơn dẫn đến sự tiếp xúc gần hơn giữa protein và đầu dò huỳnh quang gắn vào nó, có khả năng tạo ra hiệu ứng dập tắt biểu hiện trong thời gian sống của đầu dò rút ngắn (τ) , như đã mô tả trước đây40.,41 ,42.Ngoài ra, đối với các mẫu được dán nhãn kép (AF488 và Atto647N lần lượt là thuốc nhuộm cho và nhận FRET), việc giảm τ này cũng có thể đi kèm với sự ngưng tụ coacervate và tăng hiệu quả FRET (E) trong LSPT.Chúng tôi đã theo dõi sự hình thành mảng và vết theo thời gian trong các mẫu LLPS αS/Tau441 và αS/ΔNt-Tau (25 µM mỗi protein trong bộ đệm LLPS chứa 1 µM AF488 được dán nhãn αS và/hoặc Atto647N được dán nhãn Tau441 hoặc ΔNt-Tau).Chúng tôi quan sát thấy xu hướng chung là tuổi thọ huỳnh quang của đầu dò AF488 (τ488) và Atto647N (τ647N) giảm nhẹ khi các coacervate trưởng thành (Hình 6 và Hình bổ sung 8c).Điều thú vị là, sự thay đổi này đã được tăng cường đáng kể đối với các chấm trong bè (Hình 6c), cho thấy sự ngưng tụ protein tiếp theo xảy ra tại các chấm.Để hỗ trợ cho điều này, không có thay đổi đáng kể nào về tuổi thọ huỳnh quang được quan sát đối với các giọt αS/ΔNt-Tau trong 24 giờ (Hình bổ sung 8d), cho thấy rằng quá trình tạo gel của giọt là một quá trình khác biệt với đốm và không đi kèm với việc tái tổ chức phân tử đáng kể trong coacervates.Cần lưu ý rằng các dấu chấm có kích thước khác nhau và nội dung thay đổi trong αS, đặc biệt đối với hệ thống αS/Tau441 (Hình bổ sung 8e).Sự giảm tuổi thọ huỳnh quang tại chỗ đi kèm với sự gia tăng cường độ, đặc biệt đối với Tau441 có nhãn Atto647N (Hình bổ sung 8a) và hiệu suất FRET cao hơn cho cả hệ thống αS/Tau441 và αS/ΔNt-Tau, cho thấy sự ngưng tụ tiếp theo trong LLPS Năm giờ sau khi kích hoạt, các protein bên trong tĩnh điện sẽ ngưng tụ.So với αS/ΔNt-Tau, chúng tôi quan sát thấy giá trị τ647N thấp hơn và giá trị τ488 cao hơn một chút ở các điểm αS/Tau441, kèm theo các giá trị FRET thấp hơn và không đồng nhất hơn.Có thể, điều này có thể liên quan đến thực tế là trong hệ thống αS/Tau441, độ phong phú của αS được quan sát và dự kiến ​​trong các tập hợp không đồng nhất hơn, thường được cân bằng hóa học dưới mức so với Tau, vì bản thân Tau441 cũng có thể trải qua LLPS và tổng hợp (Hình bổ sung 8e) .Tuy nhiên, mức độ kết tụ giọt nước, hình thành bè và quan trọng là sự kết tụ protein trong các tụ tụ giống chất lỏng là tối đa khi có mặt cả Tau441 và αS.
hình ảnh kính hiển vi huỳnh quang trọn đời (FLIM) của αS/Tau441 và αS/ΔNt-Tau ở mức 25 μM của mỗi protein (1 μM αS được gắn nhãn AF488 và 1 μM Tau441 được gắn nhãn Atto647N hoặc ΔNt-Tau) trong bộ đệm LLPS.Các cột hiển thị hình ảnh đại diện của các mẫu LLPS ở các thời điểm trưởng thành khác nhau (30 phút, 5 giờ và 24 giờ).Khung màu đỏ hiển thị vùng chứa các điểm αS/Tau441.Tuổi thọ được hiển thị dưới dạng thanh màu.Thanh tỷ lệ = 20 µm cho tất cả hình ảnh.b Hình ảnh FLIM phóng to của vùng được chọn, được hiển thị trong hộp màu đỏ trong bảng a.Phạm vi tuổi thọ được hiển thị bằng thang màu giống như trong bảng a.Thanh tỷ lệ = 5 µm.c Biểu đồ hiển thị AF488 (được gắn vào αS) hoặc Atto647N (được gắn vào Tau) đối với các loại protein khác nhau (giọt-D-, bè-R- và đốm-P) được xác định trong các hình ảnh FLIM được ghi lại cho thời gian phân bố theo thời gian của αS-) của Tau441 và Các mẫu đồng phát αS/ΔNt-Tau (N = 17-32 ROI cho D, 29-44 ROI cho R và 21-51 ROI cho điểm).Giá trị trung bình và trung vị lần lượt được hiển thị dưới dạng hình vuông màu vàng và đường màu đen bên trong hộp.Giới hạn dưới và giới hạn trên của hộp tương ứng là tứ phân vị thứ nhất và thứ ba, đồng thời các giá trị tối thiểu và tối đa trong phạm vi liên tứ phân vị 1,5 lần (IQR) được hiển thị dưới dạng râu.Các ngoại lệ được hiển thị dưới dạng kim cương đen.Ý nghĩa thống kê giữa các cặp phân phối được xác định bằng cách sử dụng phép thử t hai mẫu, giả sử phương sai không bằng nhau.Giá trị p kiểm tra t hai đuôi được hiển thị bằng dấu hoa thị cho từng cặp dữ liệu được so sánh (* p-value > 0,01, ** p-value > 0,001, *** p-value > 0,0001, **** giá trị p > 0,00001), ns Biểu thị mức độ không đáng kể (giá trị p > 0,05).Các giá trị p chính xác được đưa ra trong Bảng bổ sung 1 và dữ liệu gốc được trình bày dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Để chứng minh rõ hơn bản chất giống amyloid của các đốm/tập hợp, chúng tôi đã xử lý các mẫu coacervate không nhuộm màu trong 24 giờ với nồng độ cao (1 M) NaCl, dẫn đến việc tách các tập hợp khỏi các coacervate protein.Khi quan sát các tập hợp cô lập (tức là dung dịch tập hợp phân tán) bằng kính hiển vi lực nguyên tử (AFM), chúng tôi đã quan sát thấy hình thái chủ yếu là hình cầu với chiều cao đều đặn khoảng 15 nm, có xu hướng liên kết trong điều kiện nồng độ muối cao, tương tự như hoạt động của các sợi cơ amyloid điển hình do hiệu ứng kỵ nước mạnh trên bề mặt (lưu ý rằng các sợi cơ thường có chiều cao ~ 10nm) (Hình bổ sung 10a).Điều thú vị là, khi các tập hợp phân lập được ủ với ThT trong xét nghiệm huỳnh quang ThT tiêu chuẩn, chúng tôi đã quan sát thấy hiệu suất lượng tử huỳnh quang ThT tăng lên đáng kể, có thể so sánh với hiệu suất được quan sát thấy khi thuốc nhuộm được ủ với các sợi amyloid αS điển hình (Hình bổ sung 10b), cho thấy rằng các tập hợp coacervate chứa các cấu trúc giống amyloid..Trên thực tế, các cốt liệu có khả năng chịu được nồng độ muối cao nhưng nhạy cảm với guanidine clorua 4 M (GdnHCl), giống như các sợi amyloid điển hình (Hình bổ sung 10c).
Tiếp theo, chúng tôi đã phân tích thành phần của các tập hợp bằng cách sử dụng huỳnh quang phân tử đơn, quang phổ tương quan huỳnh quang/tương quan chéo cụ thể (FCS/FCCS) và phân tích cụm phát hiện trùng khớp hai màu (TCCD).Để đạt được mục đích này, chúng tôi đã phân lập các tập hợp được hình thành sau 24 giờ ủ trong 100 μl mẫu LLPS chứa αS và Tau441 (cả hai đều 25 μM) cùng với 1 μM αS được gắn nhãn AF488 và 1 μM Tau441 được gắn nhãn Atto647N.Pha loãng dung dịch cốt liệu phân tán thu được thành trạng thái đơn phân tử bằng cách sử dụng cùng dung dịch đệm không có PEG và NaCl 1 M (cùng loại dung dịch đệm được sử dụng để tách cốt liệu khỏi coacervate) để ngăn chặn mọi tương tác tĩnh điện có thể xảy ra giữa LLPS và protein.Có thể xem một ví dụ về quỹ đạo thời gian của một phân tử trong Hình 7a.Phân tích FCCS/FCS (tương quan chéo, CC và tự tương quan, AC) cho thấy rằng các tập hợp chứa αS và tau có nhiều trong các mẫu (xem đường cong CC trong Hình 7b, bảng bên trái) và lượng protein đơn phân dư thừa phát sinh khi kết quả của quá trình pha loãng (xem đường cong AC trong Hình 7b, bảng bên trái).Các thí nghiệm đối chứng được thực hiện trong cùng điều kiện dung dịch sử dụng các mẫu chỉ chứa protein đơn phân cho thấy không có đường cong CC và đường cong AC rất phù hợp với mô hình khuếch tán một thành phần (Phương trình 4), trong đó protein đơn phân có hệ số khuếch tán dự kiến ​​(Hình 7b) ), bảng bên phải).Hệ số khuếch tán của các hạt tổng hợp nhỏ hơn 1 µm2/s và của protein đơn phân là khoảng 1 µm2/s.50–100 µm/giây;các giá trị tương tự với các giá trị được công bố trước đây đối với các sợi amyloid αS được siêu âm và αS đơn phân riêng biệt trong các điều kiện dung dịch tương tự44.Khi chúng tôi phân tích các cốt liệu bằng phân tích vụ nổ TCCD (Hình 7c, bảng trên cùng), chúng tôi nhận thấy rằng trong mỗi cốt liệu riêng biệt (dị hợp chất αS/Tau), khoảng 60% cốt liệu được phát hiện chứa cả αS và tau, chỉ chứa khoảng 30% tau, chỉ khoảng 10% αS.Phân tích cân bằng hóa học của các tập hợp dị thể αS/Tau cho thấy rằng hầu hết các tập hợp dị thể đều được làm giàu tau (cân bằng hóa học dưới 0,5, số lượng phân tử tau trung bình trên mỗi tập hợp nhiều hơn 4 lần so với các phân tử αS), điều này phù hợp với nghiên cứu của chúng tôi được quan sát tại FLIM tại chỗ. thí nghiệm..Phân tích FRET cho thấy các tập hợp này chứa cả hai protein, mặc dù giá trị FRET thực tế trong trường hợp này không có tầm quan trọng lớn, vì sự phân bố fluorophores trong mỗi tập hợp là ngẫu nhiên do có quá nhiều protein không được gắn nhãn được sử dụng trong thí nghiệm.Điều thú vị là, khi chúng tôi thực hiện phân tích tương tự bằng cách sử dụng biến thể Tau thiếu tập hợp amyloid trưởng thành 45,46 (xem Hình bổ sung 11a, b), chúng tôi nhận thấy rằng mặc dù tập hợp tĩnh điện αS giống nhau (Hình bổ sung 11c, d), khả năng hình thành các tập hợp trong coacervate đã giảm đáng kể và FLIM đã phát hiện một số điểm trong các thí nghiệm tại chỗ và các đường cong tương quan chéo yếu đã được quan sát thấy đối với các mẫu tổng hợp bị cô lập.Tuy nhiên, đối với một số lượng nhỏ các tập hợp được phát hiện (chỉ 1/10 của Tau441), chúng tôi quan sát thấy rằng mỗi tập hợp được làm giàu về αS so với biến thể Tau này, với khoảng 50% các tập hợp được phát hiện chỉ chứa các phân tử αS và αS vượt quá không đồng nhất .các cốt liệu (xem Hình bổ sung 11e), trái ngược với các cốt liệu không đồng nhất do Tau441 tạo ra (Hình 6f).Kết quả của các thí nghiệm này cho thấy rằng mặc dù bản thân αS có khả năng tích lũy tau trong tụ tụ, quá trình tạo mầm tau thuận lợi hơn trong những điều kiện này và các tập hợp giống amyloid thu được có thể hoạt động như một dạng của αS và tau.Tuy nhiên, một khi lõi giàu tau được hình thành, các tương tác dị hình giữa αS và tau sẽ được ưa chuộng trong các tập hợp hơn là các tương tác đồng hình giữa các phân tử tau;chúng tôi cũng quan sát mạng lưới protein trong các chất đông tụ αS/tau lỏng.
một dấu vết huỳnh quang tạm thời đại diện của các phân tử đơn lẻ của các tập hợp cô lập được hình thành trong các chất kết tủa tĩnh điện αS/Tau441.Các vụ nổ tương ứng với các tập hợp αS/Tau441 (các vụ nổ trên ngưỡng chỉ định) đã được quan sát thấy trong ba kênh phát hiện (phát xạ AF488 và Atto647N sau khi kích thích trực tiếp, các vạch xanh lam và đỏ, phát xạ Atto647N sau khi kích thích gián tiếp), FRET, vạch tím).b Phân tích FCS/FCCS của một mẫu tập hợp αS/Tau441 riêng biệt thu được từ LLPS (bảng bên trái).Các đường cong tự tương quan (AC) cho AF488 và Atto647N lần lượt được hiển thị bằng màu xanh lam và đỏ, và các đường cong tương quan chéo (CC) liên quan đến các cốt liệu chứa cả hai loại thuốc nhuộm được hiển thị bằng màu tím.Các đường cong AC phản ánh sự hiện diện của các loại protein đơn phân và tổng hợp được dán nhãn, trong khi các đường cong CC chỉ hiển thị sự khuếch tán của các loại protein tổng hợp có nhãn kép.Phân tích tương tự, nhưng trong cùng điều kiện dung dịch như ở các điểm biệt lập, các mẫu chỉ chứa αS đơn phân và Tau441 được hiển thị dưới dạng đối chứng ở bảng bên phải.c Phân tích đèn flash huỳnh quang của các phân tử đơn lẻ của các tập hợp cô lập được hình thành trong các chất kết tủa tĩnh điện αS/Tau441.Thông tin cho mỗi tổng hợp được tìm thấy trong bốn lần lặp lại khác nhau (N = 152) được vẽ dựa trên phép cân bằng hóa học, giá trị S và hiệu quả FRET của chúng (bảng trên cùng, thanh màu phản ánh sự xuất hiện).Có thể phân biệt ba loại cốt liệu: cốt liệu chỉ -αS với S~1 và FRET~0, cốt liệu chỉ Tau với S~0 và FRET~1, và cốt liệu Tau/αS không đồng nhất với S~1 và FRET trung gian. của cả hai protein đánh dấu được phát hiện trong mỗi tập hợp không đồng nhất (N = 100) được hiển thị ở bảng bên dưới (thang màu phản ánh sự xuất hiện).Dữ liệu thô được cung cấp dưới dạng tệp dữ liệu thô.
Sự trưởng thành hoặc lão hóa của chất ngưng tụ protein lỏng thành cấu trúc giống như gel hoặc rắn theo thời gian đã được báo cáo là có liên quan đến một số chức năng sinh lý của chất ngưng tụ47 cũng như bệnh tật, như một quá trình bất thường trước sự kết tụ amyloid 7, 48, 49. Ở đây chúng tôi nghiên cứu sự phân tách pha và hành vi một cách chi tiết.LSPT αS với sự hiện diện của các polycation ngẫu nhiên trong môi trường được kiểm soát ở nồng độ micromol thấp và các điều kiện liên quan đến sinh lý (lưu ý rằng nồng độ sinh lý được tính toán của αS là >1 µM50), tuân theo hành vi điều khiển nhiệt động điển hình của LPS.Chúng tôi nhận thấy rằng αS, chứa vùng đầu C tích điện âm cao ở pH sinh lý, có thể hình thành các giọt giàu protein trong dung dịch nước thông qua LLPS khi có mặt các peptide bị rối loạn cation cao như pLK hoặc Tau thông qua quá trình tĩnh điện. ngưng tụ phức tạp với sự có mặt của các đại phân tử tập hợp.Quá trình này có thể có tác động liên quan đến môi trường tế bào nơi αS gặp các phân tử đa cation khác nhau liên quan đến sự tập hợp liên quan đến bệnh tật của nó cả in vitro và in vivo51,52,53,54.
Trong nhiều nghiên cứu, động lực học của protein trong các giọt được coi là một trong những yếu tố chính quyết định quá trình trưởng thành55,56.Trong các αS tĩnh điện kết hợp với các polycation, quá trình trưởng thành rõ ràng phụ thuộc vào cường độ tương tác với các polycation, hóa trị và tính bội số của các tương tác này.Lý thuyết cân bằng gợi ý rằng bối cảnh cân bằng của hai trạng thái lỏng sẽ là sự hiện diện của một giọt lớn giàu polyme sinh học thúc đẩy LLPS57,58.Sự tăng trưởng của giọt có thể đạt được bằng quá trình trưởng thành Ostwald59, sự kết tụ60 hoặc tiêu thụ monome tự do trong pha phân tán61.Đối với αS và Tau441, ΔNt-Tau hoặc pLK, phần lớn protein được cô đặc ở dạng ngưng tụ trong các điều kiện được sử dụng trong nghiên cứu này.Tuy nhiên, trong khi các giọt tau có kích thước đầy đủ kết tụ nhanh chóng khi làm ướt bề mặt, thì sự kết tụ và làm ướt của giọt nước lại khó khăn đối với ΔNt-Tau và pLK, cho thấy sự mất đi nhanh chóng các đặc tính chất lỏng trong hai hệ thống này.Theo phân tích FLIM-FRET của chúng tôi, các giọt pLK và ΔNt-Tau lâu đời cho thấy mức độ tập hợp protein tương tự (tuổi thọ huỳnh quang tương tự) như các giọt ban đầu, cho thấy mạng lưới protein ban đầu được giữ lại, mặc dù cứng hơn.
Chúng tôi hợp lý hóa kết quả thử nghiệm của mình theo mô hình sau (Hình 8).Các giọt hình thành tạm thời ban đầu thường là mạng protein không có khả năng bù tĩnh điện và do đó có những vùng mất cân bằng điện tích, đặc biệt là ở bề mặt phân cách giữa các giọt, dẫn đến các giọt có thế năng bề mặt tĩnh điện cao.Để bù điện tích (hiện tượng thường được gọi là suy giảm hóa trị) và giảm thiểu điện thế bề mặt của các giọt, các giọt có thể bao gồm các polypeptide mới từ pha loãng, tổ chức lại mạng lưới protein để tối ưu hóa tương tác điện tích-điện tích và tương tác với các giọt khác.với bề mặt (làm ướt).Các giọt αS/pLK, do mạng lưới protein đơn giản hơn (chỉ có các tương tác dị hình giữa αS và pLK) và ái lực lớn hơn đối với các tương tác protein-protein, dường như có thể cân bằng điện tích của chất ngưng tụ nhanh hơn;quả thực, chúng tôi đã quan sát thấy động học protein trong các chất đồng tồn tại αS/pLK được hình thành ban đầu nhanh hơn so với trong αS/Tau.Sau khi cạn kiệt hóa trị, các tương tác trở nên ít phù du hơn và các giọt mất đi tính chất lỏng và biến thành các giọt giống như gel, không bắt lửa với điện thế bề mặt tĩnh điện thấp (và do đó không thể làm ướt bề mặt).Ngược lại, các giọt αS/Tau kém hiệu quả hơn trong việc tối ưu hóa cân bằng điện tích giọt do mạng lưới protein phức tạp hơn (với cả tương tác đồng hình và dị hình) và bản chất yếu hơn của tương tác protein.Điều này dẫn đến các giọt duy trì hoạt động của chất lỏng trong thời gian dài và thể hiện thế năng bề mặt tĩnh điện cao có xu hướng giảm thiểu bằng cách kết tụ và phát triển (do đó giảm thiểu tỷ lệ diện tích bề mặt/thể tích của các giọt) và bằng cách làm ướt bề mặt ưa nước.Điều này tạo ra các thư viện protein đậm đặc lớn có khả năng giữ lại các đặc tính của chất lỏng vì các tương tác vẫn rất nhất thời do liên tục tìm kiếm tối ưu hóa điện tích trong mạng lưới protein.Điều thú vị là, các dạng Tau bị cắt cụt ở đầu N, bao gồm một số dạng đồng phân xuất hiện tự nhiên62, biểu hiện đặc tính trung gian, với một số chất kết tụ bị lão hóa với αS thành các giọt giống như gel tồn tại lâu dài, trong khi các dạng khác biến đổi thành chất lỏng ngưng tụ lớn.Tính hai mặt này trong quá trình trưởng thành của chất ngưng tụ tĩnh điện αS phù hợp với các nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm LLPS gần đây đã xác định mối tương quan giữa sự suy giảm hóa trị và sàng tĩnh điện trong nước ngưng là chìa khóa để kiểm soát kích thước nước ngưng và tính chất chất lỏng.Cơ chế 58,61.
Sơ đồ này thể hiện con đường tổng hợp amyloid giả định cho αS và Tau441 thông qua LLPS và LSPT.Với các vùng giàu anion (màu đỏ) và giàu cation (màu xanh) bổ sung, các chất kết tụ tĩnh điện αS và tau có hóa trị thỏa đáng có năng lượng bề mặt thấp hơn và do đó ít kết tụ hơn, dẫn đến lão hóa giọt nước nhanh chóng.Đạt được trạng thái gel ổn định không kết tụ..Tình huống này rất thuận lợi trong trường hợp hệ thống αS/pLK do ái lực cao hơn và mạng lưới tương tác cặp protein đơn giản hơn, cho phép chuyển đổi nhanh chóng giống như gel.Ngược lại, các giọt có hóa trị không đạt yêu cầu và do đó, các vùng tích điện protein có sẵn để tương tác, giúp coacervate dễ dàng kết hợp và làm ướt bề mặt ưa nước để giảm năng lượng bề mặt cao của nó.Tình huống này thích hợp hơn cho các tập hợp tụ αS/Tau441, có mạng lưới phức hợp đa hóa trị bao gồm các tương tác Tau-Tau và αS-Tau yếu.Đổi lại, các chất đông tụ lớn hơn sẽ dễ dàng giữ được các đặc tính giống chất lỏng của chúng hơn, cho phép xảy ra các tương tác giữa protein với protein khác.Cuối cùng, các tập hợp không đồng nhất amyloid chứa cả αS và tau hình thành trong dịch đông tụ, có thể liên quan đến những tập hợp được tìm thấy trong thể vùi, là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thoái hóa thần kinh.
Các cấu trúc lớn giống như chất lỏng được hình thành trong quá trình trưởng thành của αS/Tau441 với môi trường protein năng động nhưng có độ tắc nghẽn cao và, ở mức độ thấp hơn, các chất đông tụ αS/ΔNt-Tau là nguồn dự trữ lý tưởng cho quá trình tạo mầm của quá trình tổng hợp protein.Chúng tôi thực sự đã quan sát thấy sự hình thành các tập hợp protein rắn trong loại protein đông tụ này, thường chứa cả αS và tau.Chúng tôi đã chỉ ra rằng các tập hợp dị thể này được ổn định bằng các tương tác không tĩnh điện, có thể liên kết thuốc nhuộm ThT đặc hiệu amyloid giống như các sợi amyloid điển hình và thực sự có khả năng chống lại các ảnh hưởng khác nhau tương tự.Các tập hợp αS/tau được hình thành bởi LLPS đã được chứng minh là có đặc tính giống amyloid.Thật vậy, biến thể trưởng thành của Tau thiếu khả năng kết tụ amyloid bị suy giảm đáng kể trong quá trình hình thành các tập hợp αS không đồng nhất này bên trong chất kết tụ tĩnh điện lỏng.Sự hình thành các tập hợp αS/Tau441 chỉ được quan sát thấy bên trong các tập hợp tụ, chúng vẫn giữ được các đặc tính giống chất lỏng và không bao giờ xảy ra nếu các tập tụ/giọt tụ không đạt đến trạng thái gel.Trong trường hợp sau, cường độ tương tác tĩnh điện tăng lên và do đó, độ cứng của mạng lưới protein ngăn cản sự sắp xếp lại về hình dạng cần thiết của protein để thiết lập các tương tác protein mới cần thiết cho quá trình tạo mầm amyloid.Tuy nhiên, điều này có thể đạt được ở các chất kết tụ giống chất lỏng, linh hoạt hơn, do đó chúng có nhiều khả năng duy trì chất lỏng hơn khi chúng tăng kích thước.
Thực tế là sự hình thành các cốt liệu trong pha ngưng tụ được ưu tiên ở các chất ngưng tụ αS/Tau lớn hơn là trong các giọt nhỏ tạo gel nhanh chóng, làm nổi bật sự liên quan của việc xác định các yếu tố kiểm soát sự kết tụ của giọt.Vì vậy, không chỉ có xu hướng tách pha mà kích thước của chất ngưng tụ phải được kiểm soát để hoạt động bình thường cũng như phòng ngừa bệnh tật58,61.Kết quả của chúng tôi cũng nêu bật tầm quan trọng của sự cân bằng giữa LLPS và LSPT đối với hệ thống αS/Tau.Mặc dù sự hình thành giọt có thể bảo vệ chống lại sự kết tụ amyloid bằng cách giảm lượng monome protein có sẵn trong điều kiện bão hòa, như đã được đề xuất trong các hệ thống khác63,64, phản ứng tổng hợp giọt ở mức độ giọt cao có thể dẫn đến sự kết tụ protein bên trong thông qua việc sắp xếp lại hình dạng chậm.mạng lưới protein..
Nhìn chung, dữ liệu của chúng tôi nhấn mạnh mạnh mẽ đến mức độ liên quan của hóa trị gắn kết và các tương tác hài lòng/không hài lòng trong các mạng thả trong bối cảnh LSPT.Cụ thể, chúng tôi chứng minh rằng các chất ngưng tụ αS/Tau441 có chiều dài đầy đủ có khả năng kết hợp và tạo mầm một cách hiệu quả để tạo thành các tập hợp dị thể giống amyloid bao gồm cả hai protein và đề xuất một cơ chế phân tử dựa trên kết quả thử nghiệm của chúng tôi.Sự kết hợp của hai protein trong chất dịch đông tụ αS/Tau mà chúng tôi báo cáo ở đây thực sự có thể liên quan đến sự đồng vị trí của hai protein trong các thể vùi, vốn là dấu hiệu đặc trưng của bệnh và có thể góp phần tìm hiểu mối quan hệ giữa LLPS và tập hợp amyloid, mở đường cho IDP tích điện cao trong thoái hóa thần kinh.
Các biến thể monomeric WT-αS, cysteine ​​​​(Q24C-αS, N122C-αS) và ΔCt-αS (Δ101-140) được biểu thị bằng E. coli và được tinh chế như mô tả trước đây.5 mM DTT được đưa vào tất cả các bước trong quá trình tinh chế các đột biến cysteine ​​​​αS để ngăn chặn sự hình thành liên kết disulfide.Đồng dạng Tau441 (plasmid thu được từ Addgene #16316), biến thể ΔNt-Tau (Δ1–150, thu được bằng cách nhân bản IVA với các đoạn mồi CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTTCTTAAAGTTAAAC) và biến thể AggDef-Tau (Δ275–311, được tinh chế bằng mồi GGCTC5) Nuôi cấy E. coli đã được tăng lên OD600 = 0,6–0,7 ở 37°C và 180 vòng/phút, và biểu hiện được tạo ra bằng IPTG trong 3 giờ ở 37°C.Thu hoạch tế bào ở tốc độ 11.500 xg trong 15 phút ở 4°C và rửa bằng dung dịch đệm nước muối chứa 150 mM NaCl.Hòa lại cặn trong dung dịch đệm ly giải (20 ml mỗi 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, Copeptin 100 μM).Bước siêu âm được thực hiện trên băng với biên độ 80% trong 10 xung (bật 1 phút, tắt 1 phút).Không vượt quá 60 ml trong một lần siêu âm.Lysate E. coli được làm nóng ở 95° C. trong 20 phút, sau đó làm lạnh trên đá và ly tâm ở tốc độ 127.000×g trong 40 phút.Chất nổi phía trên đã được làm rõ được áp dụng cho màng 3,5 kDa (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Vương quốc Anh) và thẩm tách với 4 L dung dịch đệm lọc máu (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0,1 mM) trong 10 giờ.Cột trao đổi cation 5 ml (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) đã được cân bằng với dung dịch đệm cân bằng (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Lysate tau được lọc qua bộ lọc PVDF 0,22 μm và bơm vào cột với tốc độ dòng 1 ml/phút.Quá trình rửa giải được thực hiện dần dần, tau được rửa giải bằng dung dịch đệm rửa giải 15–30% (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Các phân số được phân tích bằng SDS-PAGE và bất kỳ phân số nào chứa một dải có trọng lượng phân tử dự kiến ​​là tau đều được cô đặc bằng bộ lọc ly tâm 10 kDa và được thay thế bằng dung dịch đệm chứa 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM và DTT 2 mM cho nồng độ protein cuối cùng là 100 μM.Dung dịch protein sau đó được đưa qua bộ lọc PVDF 0,22 μm, đông lạnh nhanh và bảo quản ở -80°C.Protein K18 được Giáo sư Alberto Boffi vui lòng cung cấp.Độ tinh khiết của chế phẩm >95% được xác nhận bởi SDS-PAGE và MALDI-TOF/TOF.Nhiều loại cystein khác nhau đã được dán nhãn hóa học bằng AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) hoặc TEMPOL-maleimide (Toronto Research Chemicals, Toronto, Canada).đã được xác nhận bằng độ hấp thụ và MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau và K18 được dán nhãn dư lượng cysteine ​​tự nhiên ở vị trí 191 và 322 bằng cách sử dụng Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Đức) theo quy trình tương tự.Phí thực trên mỗi bản đồ dư lượng cho αS và Tau441 được tạo bằng CIDER66.
Poly-L-lysine rắn (pLK DP 90-110 theo NMR từ nhà cung cấp, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) được hòa tan trong 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, nồng độ pH 7,4 đến 10 mM, xử lý siêu âm trong 5 phút trong bể nước siêu âm và bảo quản ở -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) và FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) hòa tan trong nước và phân bố rộng rãi trong bộ đệm LLPS.Lọc máu loại bỏ muối gây ô nhiễm.Sau đó, chúng được lọc qua bộ lọc ống tiêm có kích thước lỗ 0,22 μm và nồng độ của chúng được tính toán bằng khúc xạ kế (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, Hoa Kỳ).Các mẫu LLPS được chuẩn bị ở nhiệt độ phòng theo thứ tự sau: hỗn hợp đệm và đùn được trộn và 1 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Ethane- 1, 2-diyldinitrile) axit tetraacetic (EDTA, carboxynth) và hỗn hợp chất ức chế protease 1% (PMSF 100 mM, benzimide 1 mM, leupeptin 5 μM).Sau đó, αS và các polycation hợp nhất (tùy chọn pLK hoặc Tau) được thêm vào.Đối với các thí nghiệm chuỗi thời gian thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), sử dụng tổng nồng độ ThT bằng một nửa nồng độ αS.Trộn nhẹ nhàng nhưng kỹ lưỡng các mẫu để đảm bảo chúng đồng nhất.Nồng độ của từng thành phần thay đổi tùy theo từng thử nghiệm, như được mô tả trong phần Kết quả.Azide được sử dụng ở nồng độ 0,02% (w/v) bất cứ khi nào thời gian thí nghiệm vượt quá 4 giờ.Đối với tất cả các phân tích sử dụng mẫu LLPS, để hỗn hợp cân bằng trong 5 phút trước khi phân tích.Để phân tích tán xạ ánh sáng, 150 µl mẫu được nạp vào các tấm vi mạch 96 giếng không liên kết (µClear®, màu đen, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) và được phủ một lớp màng dính.LLP được theo dõi bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng 350nm ở tâm dung dịch trong máy đọc đĩa CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Đức).Các thí nghiệm được thực hiện ba lần ở 25°C và sai số được tính bằng độ lệch chuẩn so với giá trị trung bình.Pha loãng được định lượng bằng cách ly tâm mẫu và phân tích gel SDS-PAGE, và phần αS trong pha loãng và pha đậm đặc được định lượng trong các dung dịch LLPS khác nhau.Mẫu LLPS 100 μl chứa 1 μM αS có nhãn AF488 được chuẩn bị bằng cách trộn kỹ, sau đó ly tâm ở tốc độ 9600×g trong 30 phút, sau đó thường nhìn thấy kết tủa.50 μl chất nổi phía trên được sử dụng để định lượng protein bằng gel SDS-PAGE.Gel được quét bằng bộ lọc AF488 bằng hệ thống hình ảnh gel ChemiDoc (Phòng thí nghiệm Bio-Rad, Hercules, CA, Hoa Kỳ) hoặc nhuộm bằng vết Coomassie và hiển thị bằng các bộ lọc thích hợp.Các dải kết quả được phân tích bằng ImageJ phiên bản 1.53i (Viện Y tế Quốc gia, Hoa Kỳ).Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ở hai thí nghiệm khác nhau với kết quả tương tự.
Thông thường, 150 μl mẫu được áp dụng cho các tấm vi mạch 96 giếng không liên kết và hiển thị ở nhiệt độ phòng trên kính hiển vi đảo ngược Leica DMI6000B (Leica Microsystems, Wetzlar, Đức).Đối với các thí nghiệm tại chỗ, các tấm micro-Slide Angiogenogen (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Đức) hoặc các tấm vi mạch polystyrene 96 giếng (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) cũng được sử dụng.Đèn halogen kim loại thủy ngân hoặc halogen EL6000 được sử dụng làm nguồn chiếu sáng (tương ứng cho hình ảnh BF / DIC và WF).Đối với kính hiển vi WF, vật kính không khí có độ phóng đại 40 lần (Leica Microsystems, Đức) đã được sử dụng để tập trung ánh sáng vào mẫu và thu thập nó.Đối với các mẫu có nhãn AF488 và ThT, hãy lọc kích thích và phát xạ bằng bộ lọc GFP tiêu chuẩn, bộ lọc thông dải kích thích và phát xạ tương ứng, bộ lọc thông dải 460–500 nm và 512–542 nm, và gương lưỡng sắc 495 nm.Đối với các mẫu được dán nhãn Atto647N, một bộ bộ lọc Cy5 tiêu chuẩn với các bộ lọc thông dải kích thích và phát xạ lần lượt là 628–40 nm và 692–40 nm, và gương lưỡng sắc 660 nm đã được sử dụng.Đối với kính hiển vi BF và DIC, sử dụng cùng vật kính thu ánh sáng phản xạ.Ánh sáng thu được được ghi lại trên máy ảnh Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Đức).Thời gian phơi sáng là 50 ms đối với hình ảnh kính hiển vi BF và DIC và 20-100 ms đối với hình ảnh kính hiển vi WF.Để so sánh, thời gian phơi sáng của tất cả các thử nghiệm với ThT là 100 ms.Các thí nghiệm tua nhanh thời gian đã được thực hiện để trực quan hóa sự kết tụ của giọt nước, với hình ảnh được thu thập cứ sau 100 mili giây trong vài phút.ImageJ (NIH, USA) đã được sử dụng để phân tích hình ảnh.Các thí nghiệm được thực hiện ba lần với kết quả tương tự.
Đối với các thử nghiệm colocalization, tái tạo FRAP và 3D, hình ảnh được thu được trên kính hiển vi đồng tiêu đảo ngược Zeiss LSM 880 sử dụng phiên bản màu xanh ZEN 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Đức).Các mẫu 50 µl được áp dụng cho các đĩa Petri tạo mạch µ-Slide (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Đức), được xử lý bằng polyme ưa nước (ibiTreat) và gắn vào vật kính ngâm dầu 63× (Dầu Plan-Apochromat 63×/NA 1.4) trên DIC).Hình ảnh được thu được bằng cách sử dụng các dòng laser argon 458 nm, 488 nm và 633 nm với độ phân giải 0,26 µm/pixel và thời gian phơi sáng là 8 µs/pixel đối với các cửa sổ phát hiện kích thích và phát xạ 470–600 nm, 493–628 nm, và 638–755 nm được sử dụng để hiển thị tương ứng ThT, AF488 và Atto647N.Đối với các thử nghiệm FRAP, ảnh tua nhanh thời gian của từng mẫu được ghi ở tốc độ 1 khung hình mỗi giây.Các thí nghiệm được thực hiện ba lần ở nhiệt độ phòng với kết quả tương tự.Tất cả các hình ảnh được phân tích bằng phần mềm phiên bản xanh Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Đức).Các đường cong FRAP đã được chuẩn hóa, vẽ đồ thị và khớp với dữ liệu cường độ/thời gian được trích xuất từ ​​hình ảnh bằng Zen 2 bằng OriginPro 9.1.Các đường cong phục hồi được gắn vào mô hình hàm mũ đơn để giải thích sự khuếch tán phân tử với một số hạng hàm mũ bổ sung để giải thích hiệu ứng tẩy trắng thu được.Sau đó, chúng tôi tính toán D bằng cách sử dụng bán kính tẩy trắng danh nghĩa và thời gian bán hủy thu hồi được xác định trước đó như trong phương trình của Kang và cộng sự.5 35 được hiển thị.
Các biến thể cysteine ​​đơn của αS được tổng hợp với 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ở vị trí 24 (TEMPOL-24-αS) và 122 (TEMPOL-122-αS), tương ứng.Ghi nhãn spin Đối với các thử nghiệm EPR, nồng độ αS được đặt ở 100 μM và nồng độ PEG là 15% (w/v).Đối với các điều kiện tổng hợp khác nhau, tỷ lệ αS:pLK là 1:10, trong khi tỷ lệ αS:ΔNt-Tau và αS:Tau441 được duy trì ở mức 1:1.Đối với các thí nghiệm chuẩn độ liên kết trong trường hợp không có hiện tượng đông tụ, TEMPOL-122-αS được duy trì ở mức 50 μM và các polycation được chuẩn độ ở nồng độ tăng dần, chuẩn bị từng điều kiện riêng biệt.Các phép đo CW-EPR được thực hiện bằng máy quang phổ băng tần X Bruker ELEXSYS E580 được trang bị bộ cộng hưởng Bruker ER4118 SPT-N1 hoạt động ở tần số vi sóng (SHF) ~ 9,7 GHz.Nhiệt độ được đặt ở 25°C và được kiểm soát bằng bộ điều hòa nitơ lỏng.Phổ thu được trong điều kiện không bão hòa ở công suất MW 4 mW, biên độ điều chế 0,1 mT và tần số điều chế 100 kHz.Cường độ quang phổ được chuẩn hóa để tránh sự khác biệt về nồng độ spin giữa các mẫu và khả năng giảm spin có thể xảy ra do nồng độ còn sót lại của chất khử trong các mẫu chứa Tau441 hoặc ΔNt-Tau (có trong dung dịch protein ban đầu).Các giá trị g đã cho thu được là kết quả của mô hình phổ EPR được thực hiện bằng phần mềm Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) được triển khai trong Matlab®67.Các mô hình đẳng hướng một/hai thành phần được sử dụng để mô hình hóa dữ liệu.Sau khi chuẩn hóa tất cả các tín hiệu, phần dư được tính bằng cách trừ đi từng mô phỏng khỏi phổ thử nghiệm tương ứng.Để phân tích chuẩn độ liên kết, cường độ tương đối của dải thứ ba với dải thứ hai của phổ EPR chuẩn hóa (IIII/III) đã được sử dụng để theo dõi sự liên kết của các polycation với αS.Để ước tính hằng số phân ly (Kd), đường cong kết quả được khớp với một mô hình gần đúng giả sử n vị trí liên kết độc lập và giống hệt nhau.
Các thí nghiệm quang phổ NMR được thực hiện bằng máy quang phổ NMR Bruker Neo 800 MHz (1H) được trang bị tủ lạnh và gradient Z.Tất cả các thí nghiệm được thực hiện bằng cách sử dụng 130–207 µM αS và các chất tương đương αS/ΔNt-Tau và pLK trong 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, độ pH 7,4 và được thực hiện ở 15°C.Để giám sát LPS bằng NMR, 10% PEG đã được thêm vào các mẫu trộn sẵn.Biểu đồ nhiễu loạn dịch chuyển hóa học (Hình 1b) cho thấy độ dịch chuyển hóa học trung bình 1H và 15N.Phổ αS 2D1H-15N HSQC đã được chỉ định dựa trên bài tập trước đó (mục BMRB #25227) và được xác nhận bằng cách ghi và phân tích phổ 3D của HNCA, HNCO và CBCAcoNH.Các dịch chuyển hóa học 13Cα và 13Cβ đã được tính toán với sự có mặt của ΔNt-Tau hoặc pLK để đo lường những thay đổi có thể có trong xu hướng cấu trúc thứ cấp so với các dịch chuyển hóa học αS ở dạng cuộn dây ngẫu nhiên thuần túy 68 (Hình bổ sung 5c).Tốc độ R1ρ được đo bằng cách ghi lại các thí nghiệm hsqctretf3gpsi (thu được từ thư viện Bruker) với độ trễ 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 và 800 ms, đồng thời các hàm mũ được điều chỉnh theo độ trễ cường độ cực đại ở các mức khác nhau. lần để xác định R1ρ và độ không đảm bảo thực nghiệm của nó.
Các thí nghiệm kính hiển vi huỳnh quang phân giải thời gian hai màu đã được thực hiện trên kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang MT200 phân giải thời gian thương mại (PicoQuant, Berlin, Đức) với thiết bị đếm photon đơn tương quan thời gian (TCSPC).Đầu đi-ốt laser được sử dụng để kích thích xen kẽ xung (PIE), chùm tia đi qua ống dẫn sóng một chế độ và được điều chỉnh ở công suất laser từ 10 đến 100 nW đối với các vạch laser 481 nm và 637 nm được đo sau gương lưỡng sắc.Điều này đảm bảo tốc độ đếm photon tối ưu, tránh ảnh hưởng của hiện tượng răng cưa, tẩy quang và bão hòa photon.Các tấm hoặc tấm che phủ tạo mạch μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Đức) được đặt trực tiếp vào nước ngâm trên thấu kính Super Apochromat 60x NA 1.2 có vòng đệm hiệu chỉnh (Olympus Life Sciences, Waltham, Hoa Kỳ).Một gương lưỡng sắc 488/640nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) đã được sử dụng làm bộ tách chùm tia chính.Bức xạ không tập trung bị chặn bởi một lỗ có đường kính 50 micron, sau đó bức xạ tập trung được chia thành 2 đường phát hiện bằng bộ tách chùm 50/50.Bộ lọc phát xạ băng thông (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 cho thuốc nhuộm màu xanh lá cây (AF488) và 690/70 cho thuốc nhuộm màu đỏ (Atto647N) đã được sử dụng phía trước máy dò.Điốt tuyết lở đơn photon (SPAD) (Thiết bị Micro Photon, Bolzano, Ý) đã được sử dụng làm máy dò.Cả việc thu thập và phân tích dữ liệu đều được thực hiện bằng phần mềm SymphoTime64 có bán trên thị trường (PicoQuant GmbH, Berlin, Đức).
Năm mươi microlit mẫu LLPS đã được áp dụng cho các giếng tạo mạch μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Đức).Hình ảnh thu được được tập trung đến 20 µm phía trên đáy giếng để có khoảng cách làm việc khách quan tối ưu đối với các giọt lơ lửng và đến ~1 µm đối với bè và chấm có độ phân giải trục ít nhất là 0,25 µm/pixel và thời gian trễ là 400 µs/pixel.Chọn dữ liệu bằng cách áp dụng ngưỡng cường độ dựa trên cường độ tín hiệu nền trung bình (PBG, trung bình + 2σ) cho mỗi kênh sao cho chỉ chọn các giọt, bè hoặc điểm protein lỏng, lọc ra mọi nguồn gốc có thể có từ pha phân tán.Để phân tích tuổi thọ của từng loài (τ) của mỗi kênh (màu xanh lá cây, “g” cho AF488 và màu đỏ, “r” cho Atto647N), chúng tôi đã chọn các vùng quan tâm (ROI) có chứa các giọt, bè hoặc đốm (Hình bổ sung 1 ).8b) và thu được chúng bằng cách điều chỉnh độ phân rã trọn đời của chúng (τD, τR và τP tương ứng cho các giọt, bè hoặc điểm, xem Hình bổ sung 8c) trong mỗi kênh bằng cách sử dụng phân tích khớp đuôi và mô hình phân rã hai thành phần.Trung bình τ từ τ .ROI tạo ra quá ít photon để phù hợp theo cấp số nhân đã bị loại khỏi phân tích.Ngưỡng được sử dụng là <104 photon đối với bè và chấm và 103 đối với giọt.Các giọt có ngưỡng thấp hơn vì khó thu được các đường cong phân rã với giá trị cường độ cao hơn, vì các giọt trong trường ảnh thường nhỏ hơn và ít số lượng hơn.ROI có số lượng photon trên giới hạn tích lũy photon (được đặt thành >500 số lượng/pixel) cũng bị loại bỏ để phân tích.Khớp đường cong suy giảm cường độ thu được từ vùng quan tâm với cường độ ở mức 90% mức tối đa (sau cường độ tối đa của sự suy giảm một chút) kể từ khi bắt đầu thời gian sử dụng để đảm bảo nhiễu IRF tối thiểu trong khi vẫn duy trì như nhau đối với mọi mức suy giảm cường độ cài đặt Cửa sổ thời gian tương đối Đã được phân tích 25 đến 50 ROI cho bè và đốm và 15-25 ROI cho giọt, hình ảnh được chọn từ hơn 4 lần lặp lại được ghi lại từ ít nhất 3 thử nghiệm độc lập.Các thử nghiệm t hai đuôi đã được sử dụng để đánh giá sự khác biệt thống kê giữa các loài hoặc giữa các hệ thống đồng tồn tại.Để phân tích từng pixel về thời gian tồn tại (τ), tổng mức suy giảm thời gian tồn tại trên trường cho mỗi kênh đã được tính toán và thực hiện xấp xỉ mô hình suy giảm theo cấp số nhân 2/3 thành phần.Sau đó, độ suy giảm trọn đời cho mỗi pixel được điều chỉnh bằng cách sử dụng các giá trị τ đã tính toán trước đó, tạo ra hình ảnh phù hợp với FLIM giả màu.Khoảng thời gian tồn tại của phần đuôi phù hợp là như nhau trên tất cả các hình ảnh của cùng một kênh và mỗi lần phân rã tạo ra đủ lượng photon để mang lại sự phù hợp đáng tin cậy.Để phân tích FRET, các pixel được chọn bằng cách áp dụng ngưỡng cường độ thấp hơn là 100 photon, tính trung bình tín hiệu nền (FBG) là 11 photon.Cường độ huỳnh quang của mỗi kênh được hiệu chỉnh bằng các hệ số hiệu chỉnh được xác định bằng thực nghiệm: xuyên âm phổ 69 α là 0,004, kích thích trực tiếp β là 0,0305, hiệu suất phát hiện γ là 0,517.Hiệu suất FRET ở cấp độ pixel sau đó được tính bằng phương trình sau:
Trong đó FDD là cường độ huỳnh quang quan sát được trong kênh cho (màu xanh lá cây), FDA là cường độ huỳnh quang quan sát được trong kênh chấp nhận (màu đỏ) dưới sự kích thích gián tiếp và FAA là cường độ huỳnh quang quan sát được trong kênh chấp nhận (màu đỏ) dưới sự kích thích trực tiếp ( BÁNH).Các xung cường độ huỳnh quang được quan sát trong kênh).
Đặt 100 µl dung dịch phản ứng LLPS chứa 25 µM Tau441 đơn phân không nhãn (có hoặc không có 25 µM αS) vào dung dịch đệm LLPS (được bổ sung như trên) trên các vi đĩa 96 giếng không liên kết có lớp phủ lá dính và sự hình thành giọt nước được kiểm tra bằng kính hiển vi WF sau sự cân bằng.trong vòng 10 phút.Sau 48 giờ ủ ở nhiệt độ phòng, sự hiện diện của các bè và đốm protein đã được xác nhận.Sau đó cẩn thận loại bỏ chất lỏng trên bè khỏi giếng, sau đó thêm 50 L dung dịch đệm phân ly (10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 1 M, 1 mM DTT) và ủ trong 10 phút.Nồng độ muối cao đảm bảo rằng LLPS sẽ không lặp lại do PEG còn sót lại và các tổ hợp protein có thể được hình thành chỉ bằng tương tác tĩnh điện sẽ bị phân tách.Đáy giếng sau đó được cạo cẩn thận bằng đầu micropipette và dung dịch thu được được chuyển sang giếng quan sát trống.Sau khi ủ mẫu với 50 μM ThT trong 1 giờ, sự hiện diện của các điểm biệt lập được kiểm tra bằng kính hiển vi WF.Chuẩn bị các sợi nhỏ αS được siêu âm bằng cách ủ 300 µl dung dịch αS 70 µM trong PBS có độ pH 7,4, natri azide 0,01% ở 37°C và 200 vòng/phút trên máy lắc quỹ đạo trong 7 ngày.Dung dịch này sau đó được ly tâm ở tốc độ 9600×g trong 30 phút, viên được treo lại trong PBS pH 7.4 và được siêu âm (1 phút, chu kỳ 50%, biên độ 80% trong máy siêu âm Vibra-Cell VC130, Sonics, Newton, Hoa Kỳ) mẫu fibril với sự phân bố kích thước tương đối đồng đều của các sợi nhỏ.
Phân tích FCS / FCCS và phát hiện trùng khớp hai màu (TCCD) đã được thực hiện trên cùng một kính hiển vi đồng tiêu huỳnh quang phân giải thời gian MT200 (Pico-Quant, Berlin, Đức) được sử dụng cho thí nghiệm kính hiển vi FLIM-FRET sử dụng chế độ PIE.Công suất laser cho các thí nghiệm này đã được tăng thêm lên 6,0 µW (481 nm) và 6,2 µW (637 nm).Sự kết hợp của các công suất laser này đã được chọn để tạo ra độ sáng tương tự cho các cặp fluorophores được sử dụng trong khi vẫn đạt được tốc độ đếm tối ưu và tránh hiện tượng tẩy quang và bão hòa.Cả việc thu thập và phân tích dữ liệu đều được thực hiện bằng phần mềm SymphoTime64 phiên bản 2.3 có bán trên thị trường (PicoQuant, Berlin, Đức).
Các mẫu cốt liệu αS/Tau phân lập thu được bằng LLPS được pha loãng trong dung dịch đệm cách ly đến nồng độ đơn phân tử thích hợp (thường là độ pha loãng 1:500, vì các cốt liệu đã ở nồng độ thấp khi được phân lập từ các mẫu kết tủa).Các mẫu được áp dụng trực tiếp lên các lá kính phủ (Corning, USA) được phủ trước bằng dung dịch BSA ở nồng độ 1 mg/mL.
Đối với phân tích PIE-smFRET trong các kênh xanh lục và đỏ, ngưỡng cường độ thấp hơn 25 photon đã được áp dụng để lọc các tín hiệu cường độ thấp do các sự kiện đơn phân gây ra (lưu ý rằng các đơn phân nhiều hơn các mẫu tổng hợp so với các tập hợp đơn phân).Ngưỡng này được tính bằng 5 lần cường độ trung bình của các αS đơn phân thu được từ việc phân tích các mẫu đơn phân tinh khiết nhằm chọn lọc các tập hợp cụ thể để phân tích.Mạch điều khiển PIE, cùng với việc thu thập dữ liệu TSCPC, đã cho phép ứng dụng bộ lọc trọng số trọn đời giúp loại bỏ nhiễu xuyên âm nền và quang phổ.Cường độ ngọn lửa được chọn bằng cách sử dụng các ngưỡng trên đã được hiệu chỉnh bằng cách sử dụng tín hiệu nền trung bình được xác định từ biểu đồ xuất hiện so với cường độ/thùng của các mẫu chỉ có bộ đệm.Các đợt liên kết với các cốt liệu lớn thường chiếm một số thùng liên tiếp trong dấu vết thời gian (được đặt thành 1 mili giây).Trong những trường hợp này, thùng có độ bền tối đa đã được chọn.Đối với phân tích FRET và cân bằng hóa học, hệ số gamma được xác định theo lý thuyết γ (0,517) đã được sử dụng.Sự đóng góp xuyên âm quang phổ và kích thích trực tiếp là không đáng kể (được xác định bằng thực nghiệm) ở mức năng lượng laser kích thích được sử dụng.Hiệu suất và phép cân bằng hóa học của FRET trong vụ nổ được tính như sau.