Thành phần hóa học ống cuộn bằng thép không gỉ 347, Xác định các protein chaperone kháng nguyên bạch cầu A (HLA-A) mới đáp ứng interferon bằng phương pháp quang phổ khối liên kết ngang (CLMS)

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Ngoài ra, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.
Thanh trượt hiển thị ba bài viết trên mỗi slide.Sử dụng các nút quay lại và tiếp theo để di chuyển qua các trang chiếu hoặc các nút điều khiển trang chiếu ở cuối để di chuyển qua từng trang chiếu.

Mô tả Sản phẩm

Ống cuộn thép không gỉ 347L, cấp thép: SS347L

Hệ thống tín hiệu interferon tạo ra phản ứng cytokine mạnh đối với một loạt các tín hiệu bệnh lý nội tại và gây bệnh từ môi trường, dẫn đến việc tạo ra các tập hợp con protein cảm ứng interferon.Chúng tôi đã áp dụng phép đo khối phổ liên kết ngang qua trung gian DSS (CLMS) để phát hiện các tương tác protein-protein mới trong miền protein do interferon gây ra.Ngoài các protein cảm ứng interferon dự kiến, chúng tôi cũng xác định các chất cộng liên kết ngang nội phân tử và nội phân tử mới của các protein cảm ứng interferon chính tắc như MX1, USP18, OAS3 và STAT1.Chúng tôi tập trung vào việc xác nhận trực giao một tập hợp mạng protein cảm ứng interferon mới được hình thành bởi protein HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) bằng cách sử dụng phương pháp đồng kích thích miễn dịch và nghiên cứu sâu hơn của chúng bằng mô hình động lực phân tử.Mô hình hóa động lực hình thành của phức hợp protein đã tiết lộ một số vị trí tương tác phản ánh các tương tác được xác định trong các phát hiện CLMS.Cùng nhau, chúng tôi trình bày một nghiên cứu thí điểm về CLMS để xác định các phức hợp tín hiệu mới do interferon tạo ra và mong muốn sử dụng CLMS rộng rãi hơn để xác định động lực mới của tương tác protein trong môi trường vi mô khối u.
Trước khi phản ứng miễn dịch thích ứng bắt đầu, hệ thống phòng thủ bẩm sinh của vật chủ sẽ tạo ra phản ứng kháng khuẩn qua trung gian bởi một họ cytokine xoắn alpha được tiết ra gọi là interferon (IFN).Các lớp IFN loại I IFNα và IFNβ kích hoạt các phản ứng của tế bào, bao gồm các trạng thái chống vi rút, thúc đẩy quá trình chết tế bào, tiền viêm và chống tăng sinh.Ở người, 13 phân nhóm của IFNα đã được biết đến, tất cả đều tập trung trên nhiễm sắc thể 91. Đáng ngạc nhiên là chỉ có IFNα2 được nghiên cứu để sử dụng trong lâm sàng.Gần đây, người ta đặc biệt chú ý nghiên cứu các phân nhóm khác của IFNα.Một nghiên cứu gần đây cho thấy IFNα14 là một trong những dạng đồng phân hiệu quả nhất trong việc hạn chế sự sao chép của HBV2 và HIV-13,4 so với phân nhóm IFNα2 chính tắc.
Người ta đã xác định rằng các phức hợp thụ thể interferon loại I được kích hoạt (IFNAR1 và IFNAR2) kích hoạt một tầng truyền tín hiệu qua trung gian Janus kinase TYK2 và JAK15,6.Các bộ chuyển đổi tín hiệu phosphoryl hóa Janus kinase này và các bộ kích hoạt protein phiên mã (STAT1 và STAT2) trên các gốc tyrosine để bắt đầu quá trình dị hóa qua trung gian miền SH26.Sau đó, IRF9 liên kết các dị vòng STAT để tạo thành phức hợp tam phân của gen yếu tố 3 được kích thích bằng IFN (ISGF3), phức hợp này di chuyển vào nhân và tạo ra sự phiên mã của hơn 2000 gen được kích thích bằng interferon (ISG)5,6,7,8.
ISG tạo thành xương sống của hệ thống miễn dịch bẩm sinh, đặc biệt là để đối phó với sự tấn công của virus.Là tuyến phòng thủ đầu tiên chống lại sự lây nhiễm virus, các tế bào nhanh chóng triển khai các tương tác rộng rãi của protein tế bào với một loạt các hoạt động sinh học.Những protein này bao gồm các thụ thể nhận dạng mẫu, phân tử tín hiệu, yếu tố phiên mã và protein có chức năng kháng virus trực tiếp, cũng như các chất điều chỉnh tiêu cực đối với phản ứng miễn dịch9.Phần lớn thông tin về hoạt động ISG đến từ các màn hình chức năng sử dụng màn hình biểu hiện quá mức10,11 hoặc kỹ thuật làm im lặng gen (siRNA, RNAi và CRISPR)12,13 trong đó các ISG riêng lẻ được biểu hiện hoặc bị ức chế và hoạt động của chúng được kiểm tra trên nhiều loại virus khác nhau.Mặc dù các nghiên cứu này đã xác định được đặc tính chống vi-rút của từng ISG riêng lẻ, nhưng cơ chế phân tử cơ bản của từng ISG vẫn chưa được biết rõ.Người ta thường chấp nhận rằng nhiều protein tương tác với một hoặc nhiều cytokine để đảm bảo hoạt động đầy đủ, do đó, ISG tương tác trực tiếp hoặc tương tác của chúng được trung gian bởi các protein của tế bào.Ví dụ, một nghiên cứu về protein liên kết ngang quang học gần đây đã xác định ATPase VCP/p97 là đối tác tương tác chính của IFITM3, sự ức chế của nó dẫn đến các khiếm khuyết trong việc phân loại, luân chuyển và đồng vận chuyển lysosomal của IFITM3 với các hạt virus14 .Bằng cách sử dụng phương pháp kích thích miễn dịch, chúng tôi đã xác định VAPA, một loại protein liên quan đến mụn nước, là đối tác tương tác với IFITM1/2/3 làm trung gian cho sự trưởng thành của virus qua trung gian cholesterol và điều này đã được xác nhận bởi một nghiên cứu khác sử dụng hệ thống lai hai loại nấm men.Hỗ trợ khoa học 15 , 16 .
Một quá trình sinh học cơ bản liên quan đến việc ngăn chặn nhiễm trùng và biến đổi ác tính là sự trình diện kháng nguyên, được thực hiện qua trung gian là các phân tử phức hợp tương hợp mô học chính (MHC).Các peptide (dài 8-12 axit amin) từ các protein bị cắt, kết thúc sớm hoặc gấp sai được nạp vào dị vòng MHC-I (bao gồm các chuỗi nặng và nhẹ MHC-I, được gọi là β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .Kết quả là các tông đơ MHC-I ổn định được vận chuyển đến bề mặt tế bào, nơi chúng trình diện các peptide nội bào cho tế bào T CD8+ (tế bào T gây độc tế bào)17.Tế bào T nhận biết và tiêu diệt các mầm bệnh này cũng như các tế bào mang kháng nguyên đặc hiệu cho khối u.Do đó, mầm bệnh và tế bào khối u thường ngăn chặn quá trình trình diện kháng nguyên để tránh sự giám sát miễn dịch.Ngoài ra, MHC-I bị điều hòa giảm ở 40-90% khối u ở người và thường có tiên lượng xấu hơn19.
Các gen liên quan đến phản ứng với mầm bệnh phải nhanh chóng chuyển đổi giữa trạng thái nghỉ và trạng thái phiên mã hoạt động.Do đó, một số protein tế bào được đưa ra giả thuyết có liên quan đến việc đáp ứng nhu cầu IFN cao trong thời gian ngắn, bao gồm việc tái cấu trúc và biến đổi chất xúc tác 20,21.Hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào việc xác định các đối tác protein ISG riêng lẻ với sự có mặt của IFN.Một số nghiên cứu về protein và phiên mã trong hệ thống tế bào mô hình đã làm sáng tỏ tác dụng của IFN đối với bối cảnh tế bào.Tuy nhiên, mặc dù hiểu biết ngày càng tăng về động lực gây ra bởi interferon, chúng ta vẫn biết rất ít về sự liên quan của ISG.Khi xem xét tính phức tạp và động lực phụ thuộc vào thời gian của tín hiệu interferon, có hai câu hỏi được đặt ra: (i) liệu có thể ổn định và bẫy các phức hợp đa protein liên quan đến tín hiệu nhanh hay không và (ii) những tương tác này có thể được ánh xạ vào không gian 3D không?
Để giải quyết những vấn đề này, chúng tôi đã triển khai liên kết ngang hóa học qua trung gian disuccinimide (DSS) kết hợp với phép đo phổ khối (CLMS) để nghiên cứu mạng lưới tương tác protein do IFNα tạo ra và động lực học của nó.DSS bổ sung liên kết cộng hóa trị giữa các gốc gần nhất của protein và/hoặc phức hợp protein in vivo.Phân tích MS tiếp theo cho thấy các vị trí liên kết ngang cụ thể phản ánh khoảng cách không gian của các vùng trong một protein cụ thể, được gọi là liên kết bên trong hoặc các tiểu đơn vị trong phức hợp protein, được gọi là mối quan hệ qua lại.Sử dụng phương pháp này, chúng tôi đã xác định được một số phức hợp protein-protein mới cũng như mạng lưới tương tác đa protein do interferon gây ra.Bằng cách thử nghiệm thêm một tập hợp con của các tương tác mới này, chúng tôi chứng minh rằng H2BFS (FS loại H2B histone; sau đây gọi là H2B) và MDN1 đóng vai trò là đối tác ràng buộc cho HLA-A.
Tế bào Flo-1 là một trong những mô hình in vitro nổi tiếng nhất của ung thư biểu mô tuyến thực quản vì chúng mô phỏng các đặc điểm chính của khối u thực quản22,23.Tuy nhiên, không phải tất cả các khối u đều có khả năng sinh miễn dịch và để xác định xem tế bào Flo-1 có đáp ứng với điều trị bằng interferon hay không, chúng tôi đã xử lý tế bào Flo-1 với 10 ng/ml IFNα trong 72 giờ.Các tế bào Flo-1 cho thấy sự khởi phát sớm của pSTAT1 và IRF1, bắt đầu 2 giờ sau khi điều trị và tiếp tục trong 72 giờ, với mức giảm IRF1 cố định phụ thuộc vào thời gian (Hình 1A).Các ISG (MX1, IFITM1, OAS1/2 và ISG15) được phát hiện là bị cảm ứng mạnh sau 6 giờ, bắt chước các phản ứng ở pha giữa và pha muộn cổ điển đối với IFNα (Hình 1A).Cùng với nhau, những dữ liệu này cho thấy mô hình tế bào này có thể được sử dụng để nghiên cứu phản ứng interferon.
Phản ứng biểu hiện protein khác biệt trong tế bào Flo-1 sau khi xử lý bằng IFNα.( A ) Biểu hiện protein trong các tế bào Flo-1 được xử lý bằng IFNα 10 ng/ml trong 2, 6, 24, 48 và 72 giờ được phân tích bằng immunoblot bằng cách sử dụng kháng thể ISG được chỉ định.(B) Gel SDS-PAGE nhuộm màu xanh Coomassie của chiết xuất toàn bộ tế bào sau khi liên kết ngang với DSS theo thời gian và nồng độ được chỉ định.(C) immunoblot đại diện được kiểm tra bằng kháng thể p53(DO-1) từ cùng một mẫu để đánh giá mức độ liên kết ngang của protein.
Để nắm bắt được bối cảnh tương tác protein tại chỗ, chúng tôi đã sử dụng DSS, một tác nhân liên kết ngang được sử dụng rộng rãi do tính thấm màng cao và thời gian phản ứng tương đối ngắn.Thời gian phản ứng ngắn hơn giúp ngăn chặn sự hình thành các tập hợp lớn của protein liên kết ngang, từ đó duy trì sự ổn định của liên kết ngang.Để xác định nồng độ DSS tối ưu và tránh liên kết ngang quá mức, trước tiên chúng tôi đã cho các tế bào tiếp xúc với DSS 5, 2,5 và 1 mM trong tương ứng trong 5, 10, 5 và 30 phút và phân tích các dung dịch ly giải bằng SDS-PAGE nhuộm màu Coomassie (dữ liệu không được hiển thị).Dịch ly giải tế bào dường như có liên kết chéo cao ở nồng độ thấp nhất và ở thời điểm ngắn nhất.Do đó, DSS được chuẩn độ đến 1, 0,5 và 0,1 mM trong 5 phút (Hình 1B).Liên kết ngang tối ưu được quan sát với 0,5 mM DSS trong 5 phút và những điều kiện này được chọn cho các tế bào được xử lý bằng IFNα.Ngoài ra, Fig.1C thể hiện phương pháp Western blot được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể p53 (DO-1) để đánh giá mức độ liên kết ngang của protein.
Các tế bào Flo-1 được xử lý bằng IFNα 10 ng/ml trong 24 giờ trước khi thêm chất liên kết ngang.Các tế bào liên kết chéo sau đó được ly giải bằng phương pháp phân giải protein hai bước và protein được xử lý bằng FASP (Hình 2)24,25.Các peptide tryptic liên kết ngang được phân tích bằng phép đo phổ khối (Hình 2).Phổ MS/MS sau đó được khớp với trình tự protein và được định lượng bằng MaxQuant26,27.Các peptide liên kết ngang được xác định từ quang phổ thu được bằng chương trình SIM-XL và các hợp chất riêng lẻ được kết hợp thành một mạng phức tạp bằng cách sử dụng đường ống phần mềm điện toán nguồn mở xQuest28 và SIM-XL29 (Hình 2).SIM-XL xác định các tương tác protein-protein, chuỗi bên trong và chuỗi riêng lẻ trong hỗn hợp protein đơn giản hoặc phức tạp và cung cấp các tập lệnh để trực quan hóa các tương tác trong cấu trúc protein.Ngoài ra, nó xếp hạng mỗi tham chiếu chéo dưới dạng điểm ID theo chất lượng phổ MS/MS29.Một số tương tác và phức hợp protein-protein có độ tin cậy cao đã được xác định và một nhóm tương tác mới đã được nghiên cứu sâu hơn bằng cách sử dụng phương pháp đồng kích thích miễn dịch và thay đổi hình dạng của phức hợp bằng mô hình động lực phân tử (MD) (Hình 2) 30, 31.
Sơ đồ tổng quan của phương pháp CLMS.Các tế bào Flo-1 được xử lý với 10 ng/ml IFNα trong 24 giờ, sau đó liên kết ngang protein tại chỗ bằng DSS, sau đó là ly giải tế bào và cố gắng cố định.Các mẫu liên kết ngang được phân tích bằng máy quang phổ khối Orbitrap và lấy mẫu thêm để phân mảnh các tiền chất peptide trong LC-MS/MS.Hai peptide liên kết đã được xác định từ quang phổ thu được bằng chương trình Máy nhận dạng quang phổ của Peptide liên kết ngang (SIM-XL) và tất cả các hợp chất được kết hợp thành một mạng phức tạp bằng cách sử dụng các đường ống tính toán.Lọc ra các tương tác có độ tin cậy thấp dựa trên điểm số tỷ lệ dương tính giả (FDR).Một số tương tác protein-protein có độ chính xác cao mới đã được xác nhận thêm bằng cách sử dụng phương pháp đồng kích thích miễn dịch và những thay đổi về hình dạng trong các phức hợp đã được kiểm tra bằng mô hình động lực phân tử (MD).
Tổng cộng có ~ 30.500 và ~ 28.500 peptide đã được phát hiện bằng cách sử dụng MaxQuant trong các mẫu IFNα chưa được kích thích và được kích thích tương ứng (Bảng bổ trợ S1, Hình 3).Sự phân bố chiều dài peptide trong cả hai trường hợp cho thấy tỷ lệ peptide lớn hơn cao hơn, cho thấy sự hiện diện của các peptide liên kết ngang (Hình 3B, C).Ngoài ra, một tỷ lệ lớn hơn các peptide lớn hơn đã có mặt trong phạm vi 40–55 trong các mẫu được xử lý bằng IFNα (Hình 3).Ánh xạ protein theo cường độ log2 cho thấy các protein được kích thích bằng interferon cổ điển có nhiều nhất so với các mẫu chưa được xử lý, bao gồm MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 và HLA-F (Hình 3D).Phân tích các con đường cho protein được làm giàu gấp ba lần để đáp ứng với điều trị bằng IFNα bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu về con đường Reactome cho thấy rằng việc trình bày và xử lý kháng nguyên qua trung gian MHC-I là con đường chiếm ưu thế nhất (Hình 3E).Phù hợp với các báo cáo trước đó, các phản ứng chống vi-rút qua trung gian OAS và ISG15 cũng như tín hiệu IFNα/β và cytokine nằm trong số các con đường được kích hoạt.Ngoài ra, các liên kết chéo protein đặc hiệu lysine và serine đã được xác định từ phổ MS/MS thu được ban đầu bằng SIM-XL.Một nghiên cứu gần đây đã báo cáo 104 ISG bao gồm 20 loại vi-rút từ 9 loại vi-rút bằng cách phân tích tổng hợp các nghiên cứu biểu hiện quá mức ISG riêng lẻ ở 5 loại tế bào9.Tuy nhiên, để khắc phục những hạn chế về tính toán trong việc sàng lọc các tập dữ liệu lớn, chúng tôi đã bắt đầu với một tập dữ liệu nhỏ hơn để khám phá các tương tác có thể có giữa danh sách các gen IRDS được báo cáo bởi Padaria và cộng sự, hầu hết trong số đó là ISG.
Xác định các protein liên kết ngang được biểu thị khác nhau để đáp ứng với IFNα (dữ liệu thu được từ MaxQuant).(A) Biểu đồ Venn biểu thị số lượng peptide phổ biến và độc quyền được xác định trong các mẫu Flo-1 được xử lý và chưa được xử lý bằng IFNα14.Phân bố chiều dài peptide của các mẫu liên kết ngang chưa được xử lý (B) và IFNα (C).(D) Bản đồ nhiệt biểu thị log2 (cường độ LFQ) giữa các ô Flo-1 chưa được xử lý và IFNα14.Bảng bên trái hiển thị các protein được kích hoạt tích cực nhất khi có IFNα.(E) Biểu đồ biểu thị 20 con đường làm giàu chính sau khi xử lý bằng IFNα.Cơ sở dữ liệu về lộ trình Reactome đã phân tích hơn bốn lần những thay đổi trong các protein phản ứng với IFNα được điều hòa.
Sự kích thích ISG qua trung gian Interferon đã được ghi nhận rõ ràng, nhưng ở cấp độ phân tử, người ta chưa hiểu rõ làm thế nào các protein này đạt đến đỉnh cao trong một loạt các chức năng sinh học.Chúng tôi đã nghiên cứu các tương tác protein với độ tin cậy cao giữa các ISG đã biết.Điều thú vị là chúng tôi đã xác định được một mạng bao gồm các protein MX1, USP18, ROBO1, OAS3 và STAT1 tạo thành một phức hợp lớn để đáp ứng với việc xử lý bằng IFNα (Hình 4, Bảng S2) 32,33,34.Quan trọng nhất, những tương tác này được tìm thấy ở tất cả các mẫu ba lần được điều trị bằng IFNα và không được tìm thấy trong các mẫu chưa được xử lý, cho thấy rằng chúng được hình thành đặc biệt để đáp ứng với điều trị bằng IFNα.Được biết, STAT1 điều hòa phiên mã sự biểu hiện của các ISG này, nhưng sự tương tác của nó với ISG ở cấp độ protein vẫn chưa được nghiên cứu.Cấu trúc tinh thể của STAT1 cho thấy miền xoắn ốc (CCD) của nó không liên quan đến sự tương tác với DNA hoặc các proton trong quá trình hình thành các dimer35.Các chuỗi xoắn ốc này tạo thành cấu trúc xoắn ốc cung cấp diện tích bề mặt chủ yếu ưa nước để xảy ra tương tác 35 .Trong dữ liệu CLMS của chúng tôi, chúng tôi quan sát thấy rằng hầu hết các tương tác với STAT1 xảy ra trong miền SH2 trước CCD, miền liên kết hoặc đuôi C-terminal (dư lượng 700-708) (Hình 4A).Một nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng USP18 liên kết với miền liên kết CCD và DNA (DBD) của STAT2 và được tuyển dụng vào tiểu đơn vị của thụ thể interferon loại I IFNAR2 để điều hòa sự ức chế tín hiệu interferon loại I 24 .Dữ liệu của chúng tôi cũng cho thấy miền xúc tác USP18 tương tác với STAT1 DBD (Hình 4A, D), cho thấy rằng cả STAT1 và STAT2 đều có thể đóng vai trò thu hút USP18 đến với IFNAR2.
Mạng ISG protein-protein được xác định trong các tế bào liên kết chéo được xử lý bằng IFNα.(A) Biểu đồ tương tác 2D hiển thị các tương tác protein-protein (được tạo trong chương trình SIM-XL), với các dòng biểu thị các tương tác giữa các phân tử (ngắt liên kết ngang được đặt thành 3,5).Các miền có danh tính khác nhau được đánh dấu bằng color32: miền MX1, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) và GED (569–660).Các miền OAS3: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) và OAS1_C (903-108).Tên miền ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) và fn3 (777–864).Các trường STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) và STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Trình xem vòng tròn các protein liên kết ngang (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 và STAT1) với các tương tác và tương tác được dán nhãn lần lượt là màu xanh lam và đỏ.Ngưỡng liên kết chéo được đặt ở mức 3,5.Các ô chấm biểu thị các vị trí tương tác STAT1 với MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) và OAS3 (F), cũng như các vị trí tương tác K hoặc S giữa hai peptide.Trong hình, ngưỡng điểm liên kết chéo được đặt thành 3.0.(G) Các vị trí tương tác khác nhau giữa các miền STAT1 và OAS3 DI được đặt chồng lên cấu trúc protein của chúng trong PyMol (hệ thống đồ họa phân tử PyMOL, phiên bản 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (id pdb: 1bf533) và OAS3 (id pdb: 4s3n34).) chương trình.
Hai dạng đồng phân của USP18 đã được mô tả ở người, một protein có chiều dài đầy đủ chủ yếu nằm trong nhân và một dạng đồng phân không có miền đầu N, USP18-sf, được phân bố đồng đều trong tế bào chất và nhân 36 .Ngoài ra, đầu N được dự đoán là không có cấu trúc và không yêu cầu hoạt động isopeptidase hoặc liên kết ISG1537.Hầu hết các tương tác được xác định trong nghiên cứu của chúng tôi đều nằm ở đầu N của protein, cho thấy rằng những tương tác này liên quan đến USP18 có độ dài đầy đủ (Hình 4A, D) và do đó có khả năng xảy ra trong nhân.Hơn nữa, dữ liệu của chúng tôi cũng chỉ ra rằng đầu N chuyên dùng cho các tương tác giữa protein với protein.Vị trí liên kết IFNAR2 nằm giữa các gốc 312-368, và đáng chú ý là không có protein nào trong phức hợp liên kết với vùng này (Hình 4A) 37,38 .Những dữ liệu này được tổng hợp cùng nhau chỉ ra rằng miền liên kết IFNAR2 được sử dụng riêng bởi protein thụ thể.Ngoài ra, chỉ có OAS3 và ROBO1 được tìm thấy có liên quan đến các miền ngược dòng của điểm cuối N và vị trí liên kết IFNAR2 (Hình 4A).
ROBO1 thuộc siêu họ globulin miễn dịch (Ig) của các phân tử tín hiệu xuyên màng và bao gồm năm miền Ig và ba miền fibronectin (Fn) ở vùng ngoại bào.Các miền ngoại bào này được theo sau bởi vùng gần màng và một chuỗi xoắn xuyên màng đơn 39. Vùng nội bào không có cấu trúc nằm ở đầu C và chứa các mô típ trình tự được bảo tồn làm trung gian liên kết với protein tác động39.Vùng kéo dài từ axit amin ~ 1100 đến 1600 hầu hết bị rối loạn.Chúng tôi nhận thấy rằng MX1 tương tác với ROBO1 thông qua các miền Ig, Fn và nội bào, trong khi hầu hết các tương tác với STAT1 xảy ra giữa CCD, miền liên kết và đầu C của ROBO1 (Hình 4A, E).Mặt khác, các tương tác với các vùng liên kết DI, DIII và OAS3 được phân phối khắp protein ROBO1 (Hình 4A).
Họ protein oligoadenylate synthase (OAS) chấp nhận và liên kết RNA sợi đôi nội bào (DSRNA), trải qua những thay đổi về hình dạng và tổng hợp các oligoadenylate liên kết 2′,5′ (2-5 As) 40 .Người ta nhận thấy rằng trong số ba OAS, OAS3 thể hiện ái lực cao nhất với DSRNA và tổng hợp lượng 2-5 As ít nhất, có thể kích hoạt RNase L và do đó hạn chế sự nhân lên của virus41.Họ OAS bao gồm các miền transferase nucleotide giống như polymerase beta (pol-β).Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng hoạt động xúc tác của miền đầu C (DIII) phụ thuộc vào miền liên kết với DSRNA (DI), cần thiết để kích hoạt OAS342.Chúng tôi quan sát thấy miền DI và DII của OAS3 tương tác với CCD và một vùng tiếp giáp nhỏ giữa SH2 và STAT1 TAD (Hình 4A, F).Việc xếp chồng các vị trí liên kết ngang khác nhau trên cấu trúc protein cho thấy sự tương tác giữa vòng β-sheet và DBD STAT1 và một túi hoặc khoang mở được hình thành bởi các phần dư 60–75 trong miền DI của OAS3 (Hình 4G).Sự định hướng của các protein trong phức hợp cũng chỉ ra rằng không có tương tác nào với OAS3 cản trở khả năng liên kết DNA của miền DI của nó (Hình S1A).Ngoài ra, miền đầu cuối N của GTPase MX1 tương tác rộng rãi với miền DI và DIII của OAS3 (Hình 4A).Chúng tôi cũng quan sát thấy sự tương tác giữa OAS1 và MX1 trong cả ba lần lặp lại được xử lý bằng IFNα, trong đó một miền OAS1 duy nhất (cũng có hoạt tính xúc tác) tương tác với cả ba miền MX1 (Hình S2A, B).
Protein MX là một phần của một họ GTPase giống dynein lớn có chứa miền GTPase đầu N liên kết và thủy phân GTP, một miền trung gian điều hòa quá trình tự lắp ráp và dây kéo leucine đầu C hoạt động như một GTPase (LZ). ).tên miền hiệu ứng tên miền25,43.MX1 liên kết với các tiểu đơn vị polymerase của virus để ngăn chặn quá trình phiên mã của gen virus43.Một màn hình lai hai loại men được báo cáo trước đây cho thấy MX1 liên quan đến PIAS1 ức chế sự kích hoạt gen qua trung gian STAT1 bằng cách ngăn chặn hoạt động liên kết DNA và cũng có hoạt động ligase SUMO E344,45.Ở đây, chúng tôi chứng minh rằng MX1 liên kết với STAT1 (Hình 4C, D), tuy nhiên, sự tương tác này ảnh hưởng như thế nào đến việc kích hoạt gen qua trung gian STAT1 để đáp ứng với IFNα cần được nghiên cứu thêm.Ngoài ra, chúng tôi cũng phát hiện ra rằng MX1 tương tác với IFIT3 và DDX60 trong cả ba lần lặp lại được xử lý bằng IFNα (Hình S2C).
DDX60 là một helicase tế bào chất do IFN gây ra trước đây đã được báo cáo là có vai trò trong sự thoái hóa RNA46 độc lập với RIG-I.Nó tương tác với RIG-I và kích hoạt tín hiệu của nó theo cách thức phối tử cụ thể 46. DDX60 bao gồm miền helicase DEXD/H-Box và miền helicase đầu C liên kết RNA virus và DNA47.Hầu hết các tương tác của nó với MX1 và IFIT3 xảy ra trong các vùng đầu N và C dài không có miền hoặc họa tiết chính tắc (Hình S2E, F).Tuy nhiên, MX1 cũng được liên kết với miền helicase DEXD/H-Box (Hình S2E).Các protein thuộc họ IFIT có các bản sao song song của mô típ xoắn xoắn đặc biệt được gọi là lặp lại tetrapeptide (TPR).IFIT3 được phát hiện là bộ điều biến tích cực tín hiệu RIG-I và do đó là một thành phần của phức hợp MAVS.Kết hợp lại với nhau, dữ liệu của chúng tôi cho thấy IFIT3 và DDX60 tương tác chủ yếu ở vùng giữa TPR 3–6 của IFIT3 và có thể đóng một vai trò trong tín hiệu RIG-I/MAVS (Hình S2F).
Do việc sàng lọc toàn bộ hệ protein đòi hỏi tính toán chuyên sâu, nên chúng tôi đã sàng lọc toàn bộ cơ sở dữ liệu UniProt của con người để tìm sự hiện diện của một trong các đoạn lặp lại được xử lý bằng IFNα.Trong bản sao này, chúng tôi đã tìm thấy một số mạng tương tác có độ tin cậy cao dành cho HLA-A.Phân tích các con đường protein được xác định bằng phổ MS/MS cho thấy quá trình xử lý và trình diện kháng nguyên dựa trên MHC-I là con đường chính do interferon gây ra (Hình 3D).Do đó, chúng tôi tập trung nghiên cứu tương tác protein của các phân tử MHC-I với độ tin cậy cao trong tất cả các mẫu liên kết ngang.HLA bao gồm các miền α1, α2 và α3 và chuỗi nhẹ, và microglobulin β2 (β2m) là một protein đi kèm không đổi49.Sau khi được tập hợp trong mạng lưới nội chất, HLA không ổn định khi không có phối tử peptide50.Rãnh liên kết peptide được hình thành bởi các miền α1 và α2 có tính đa hình cao và không có cấu trúc ở dạng không peptide và miền α351 tương đối ít đa hình hơn.Với sự hiện diện của IFNα, chúng tôi đã phát hiện hai phức hợp HLA-A: một phức hợp tương tác với HMGA1 và H2B (Hình 5, Bảng S3) và phức hợp còn lại tương tác với MDN1, LRCH4 và H2B (Hình 6).
IFNα tạo ra mạng tương tác HLA-A với H2B (H2BFS) và HMGA1.( A ) Sơ đồ 2D (được tạo trong phần mềm SIM-XL) mô tả các loại tương tác khác nhau trong phức hợp H2B-HLA-A-HMGA1: liên kết liên kết (màu xanh), liên kết liên kết (màu đỏ) và liên kết đơn (màu đen)..Các miền nhận dạng khác nhau được mã hóa màu32: H2B (histone; 2–102) và MHC-I (MHC_1; 25–203, nhóm C1; 210–290 và MHC_I_C; 337–364).Ngưỡng liên kết chéo được đặt ở mức 3,5.Các ô chấm biểu thị các vị trí tương tác HLA-A với H2B (B) và HMGA1 (C), cũng như các vị trí tương tác K hoặc S giữa hai peptide.Trong hình, ngưỡng điểm liên kết chéo được đặt thành 3.0.(D) Mối quan hệ giữa các protein được thể hiện trong cấu trúc của protein H2B, HLA-A và HMGA1 trong chương trình PyMOL.Các cấu trúc này được mô hình hóa bằng máy chủ Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) và cấu trúc mẫu cho các protein H2B, HLA-A và HMGA1 lần lượt là 1kx552, 1kj349 và 2eze55.
IFNα tạo ra mạng tương tác HLA-A với H2B (H2BFS), MDN1 và LRCH4.( A ) Các liên kết chéo nội phân tử (màu đỏ) và liên phân tử (màu xanh) được trình bày trên bản đồ tương tác 2D (được tạo trong phần mềm SIM-XL) với MDN1 được biểu thị dưới dạng vòng tròn.Ngưỡng liên kết chéo được đặt ở mức 3,5.Các miền nhận dạng khác nhau được mã hóa màu32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, nhóm C1; 210–290 và MHC_I_C; 337–364) và LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) và CH (535–641)).(B) Mối quan hệ giữa các protein được thể hiện trong cấu trúc của protein H2B, HLA-A, LRCH4 và MDN1 trong chương trình PyMOL.Các cấu trúc này được mô hình hóa bằng máy chủ Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) với cấu trúc mẫu 1kx552, 1kj349, 6hlu62 và 6i2665 cho các protein H2B, HLA-A, LRCH4 và MDN1, tương ứng.Các ô chấm hiển thị các vị trí tương tác K hoặc S cho HLA-A với H2B (C), LRCH4 (D) và MDN1 (E).Đối với các ô, ngưỡng điểm liên kết chéo được đặt thành 3.0.
Ngoài việc duy trì tính toàn vẹn của bộ gen, histone H2B còn tham gia vào quá trình điều hòa phiên mã.Protein H2B bao gồm miền histone trung tâm (HFD) được hình thành bởi ba chuỗi xoắn ốc được phân tách bằng các vòng và đuôi C 41,52.Hầu hết sự tương tác với H2B xảy ra trong chuỗi xoắn α1, cung cấp khả năng điều chỉnh bằng dị vòng HFD (Hình 5A, B).Mặc dù lysin có liên quan đến liên kết DNA, một số lysin cũng là vị trí acetyl hóa hoặc methyl hóa thay thế.Ví dụ, các gốc K43, K46 và K57 từ H2B không liên quan đến liên kết DNA trực tiếp nhưng lại là mục tiêu của nhiều biến đổi sau phiên mã53.Tương tự, dư lượng K44, K47 và K57 trong H2B có thể đóng vai trò thay thế khi có IFNα, bao gồm cả tương tác với các protein khác (Hình 5A, B).Ngoài ra, histone H2B ngoại nhiễm sắc thể kích hoạt phản ứng miễn dịch ở nhiều loại tế bào khác nhau, hoạt động như một cảm biến tế bào để phát hiện các đoạn DNA sợi đôi (dsDNA) có nguồn gốc từ các tác nhân lây nhiễm hoặc các tế bào bị tổn thương54.Với sự hiện diện của virus DNA, sự suy giảm H2B đã ức chế quá trình sản xuất IFN-β và quá trình phosphoryl hóa STAT154.H2B cũng được biết là di chuyển vào và ra khỏi nhân nhanh hơn các histone lõi khác54.Tương tác H2B với MDN1 và LRCH4 cũng được quan sát thấy trong các mẫu được chọn chưa được xử lý.Chúng tôi nhận thấy rằng HLA-A tương tác với H2B trong cả ba mẫu được xử lý bằng IFNα và trong một mẫu lặp lại chưa được xử lý.Những dữ liệu này phản ánh vai trò của H2B trong một chức năng sinh lý thay thế độc lập với sự điều hòa phiên mã.
HMGA1 (nhóm di động cao AT-Hook 1), một nucleoprotein nhỏ giàu axit amin gây bệnh, đã được xác định có liên quan đến HLA-A.Nó có đuôi ở đầu C có tính axit và ba DBD riêng biệt được gọi là móc AT vì chúng liên kết với rãnh nhỏ của vùng giàu AT trong DSDNA55,56.Sự liên kết này làm cho DNA bị uốn cong hoặc duỗi thẳng, cho phép các yếu tố phiên mã chính tắc tiếp cận trình tự đồng thuận của nó.Đuôi đầu C được cho là có liên quan đến tương tác protein-protein và tuyển dụng các yếu tố phiên mã, do các đột biến xóa đầu C không thể bắt đầu phiên mã57.Hơn nữa, miền này chứa một số vị trí phosphoryl hóa được bảo tồn được biết đến là cơ chất cho kinase 58.Chúng tôi đã quan sát thấy các tương tác HLA-A và H2B với HMGA1 bên ngoài miền đầu cuối C, cho thấy rằng miền đầu cuối C chủ yếu được sử dụng để liên kết yếu tố phiên mã (Hình 5A, C).Các protein HMGA cạnh tranh với histone H1 để liên kết với DNA bộ điều hợp, do đó làm tăng khả năng tiếp cận57.Tương tự, có vẻ như HMGA tương tác với histone H2B dọc theo DNA liên kết để cạnh tranh với histone H1.HMGB1 gây ra sự biểu hiện của HLA-A, -B và -C trong các tế bào đuôi gai, dẫn đến sự kích hoạt của chúng59, nhưng sự tương tác giữa HMG và HLA chưa được báo cáo trước đây.Chúng tôi thấy rằng HMGA1 tương tác với các miền α1 và α3 của HLA-A, với hầu hết các tương tác bên ngoài 3 DBD của nó (Hình 5A, C).Trong tay của chúng tôi, HLA-A được phát hiện định vị trong nhân (dữ liệu không được hiển thị) và do H2B và HMGA1 cũng có trong nhân, nên sự tương tác này có thể xảy ra trong nhân.Các chất cộng cụ thể được đo giữa H2B, HLA-A và HMGA1 được hiển thị trong Hình 5D.
Hầu hết các tương tác của HLA-A với các protein khác xảy ra trong miền α1 và α2 của nó và miền đầu C bị rối loạn (Hình 6).Trong một trong những ví dụ này, chúng tôi nhận thấy rằng HLA-A tương tác với đuôi đầu N bị rối loạn của LRCH4 (Hình 6A, D).LRCH4 điều chỉnh kích hoạt TLR4 và cảm ứng cytokine LPS, từ đó điều chỉnh phản ứng miễn dịch bẩm sinh60,61.Nó là một protein màng có chín đoạn lặp giàu leucine (LRR) và mô típ tương đồng peaceodulin (CH) trong miền ectodomain của nó, tiếp theo là miền xuyên màng (TMD) 60, 62.Các miền CH đã được báo cáo là có vai trò trung gian cho các tương tác protein-protein 60 .Khoảng 300 axit amin giữa miền LRR và CH có thể tiếp cận được nhưng bị rối loạn.Dựa trên chức năng của các vùng bị rối loạn là chất trung gian của mạng lưới protein-protein và sự vận chuyển mụn nước 63, chúng tôi thấy rằng hầu hết các tương tác protein xảy ra ở các vùng bị rối loạn.Các tương tác với MDN1 được phân phối dọc theo chiều dài của protein, bao gồm các miền LRR1, LRR6, CH và các vùng ngẫu nhiên, trong khi H2B chủ yếu liên kết với miền CH (Hình 6A, B).Đáng chú ý, không có tương tác nào bao gồm TMJ, cho thấy tính đặc hiệu của phương pháp CLMS (Hình 6A, B).
MDN1 cũng đã được xác định là một phần của mạng protein HLA-A (Hình 6A).Nó thuộc họ protein AAA (ATPase liên quan đến các hoạt động khác nhau).Đây chính là miền AAA ở đầu N được tổ chức thành vòng lục giác và loại bỏ yếu tố lắp ráp khỏi tiểu đơn vị ribosome 60S 64.dường như tương tự như dynein64,65,66.Ngoài ra, vùng giàu Asp/Glu được theo sau bởi miền MIDAS (vị trí phụ thuộc ion kim loại).Do kích thước lớn của MDN1 (khoảng 5600 axit amin) và tính tương đồng hạn chế của nó với các protein được nghiên cứu kỹ lưỡng, nên người ta biết rất ít về cấu trúc và chức năng của nó ở người.Chúng tôi đã xác định HLA-A, H2B và LRCH4 là đối tác liên kết MDN1 và tiết lộ định hướng của chúng là phức hợp protein trong PyMol (Hình 6A, B).Ba protein này tương tác với miền AAA, miền liên kết giống dynein và có thể cả miền MIDAS MDN1.Trong một báo cáo trước đây, quá trình tinh chế ái lực của protein mồi đã xác định MDN1 là protein liên kết với histone H2B67.Ngoài ra, một nghiên cứu gần đây cũng báo cáo sự tương tác giữa MDN và HLA-B trong các tế bào HCT116 bằng phương pháp quang phổ khối tinh khiết ái lực, hỗ trợ cho phát hiện của chúng tôi68.Việc xác định phức hợp này trong các mẫu được xử lý bằng IFNα cho thấy vai trò của MDN1 trong việc truyền tín hiệu interferon.
Do các gen HLA có tính đa hình cao nên chúng tôi đã trích xuất các bản đồ đọc trình tự HLA-A, -B và -C từ dữ liệu giải trình tự RNA của các tế bào Flo-1 (dữ liệu không được hiển thị).Trình tự peptide phù hợp với cách đọc trình tự cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa HLA-A, -B và -C ở những vùng có peptide liên kết ngang trong HLA-A (Hình S3).Ngoài ra, chúng tôi không quan sát thấy liên kết ngang giữa protein với protein của các phân tử HLA-B/C với protein H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Điều này cho thấy rằng tương tác protein được tìm thấy giữa HLA-A, MDN1, LRCH1 và HMGA1 là đặc hiệu với HLA-A.Ngoài ra, phân tích protein của các mẫu không liên kết ngang (Bảng S4) cho thấy HLA-A có độ bao phủ trình tự cao hơn so với HLA-B hoặc HLA-C.Các peptide được xác định cho HLA-A có cường độ cao trong cả mẫu được xử lý bằng IFNα và mẫu không được xử lý.
Để đảm bảo rằng các tương tác được xác định ở đây không phải do liên kết chéo không đặc hiệu của hai protein ở khoảng cách gần nhau về mặt không gian, chúng tôi đã xác nhận thêm hai yếu tố tương tác HLA-A mới bằng cách thực hiện các thử nghiệm đồng kích thích miễn dịch.Các tương tác HLA-A với MDN1 và H2B nội sinh đã được phát hiện trong cả tế bào Flo-1 được xử lý bằng IFNα và không được xử lý (Hình 7, Hình S4).Chúng tôi xác nhận rằng HLA-A đã bị H2B bắt giữ trong các chất kích thích miễn dịch và mối liên quan này là do điều trị bằng IFNα vì HLA-A không có trong các mẫu kích thích miễn dịch từ các tế bào không được điều trị (Hình 7A).Tuy nhiên, dữ liệu của chúng tôi cho thấy IFNα quy định khác nhau về liên kết HLA-A với H2B và MDN1.IFNα tạo ra sự liên kết giữa H2B và HLA-A, nhưng làm giảm sự liên kết của nó với MDN1.Chúng tôi nhận thấy rằng MDN1 được liên kết với HLA-A trong các điều khiển và việc bổ sung IFNα đã làm giảm sự tương tác này mà không phụ thuộc vào cảm ứng MDN1 bởi IFNα (Hình 7B, C).Ngoài ra, phản ứng kích thích miễn dịch HLA-A đã thu được H2B trong các tế bào A549 (Hình S4), cho thấy rằng sự tương tác này không phụ thuộc vào loại tế bào.Kết hợp lại với nhau, những kết quả này hỗ trợ các tương tác qua trung gian interferon của HLA-A với H2B và MDN1.
HLA-A đồng thanh lọc H2B và MDN1.Các tế bào miễn dịch H2B (A) và MDN1 (B) nội sinh đại diện đã được kích thích miễn dịch từ các tế bào Flo-1 được điều trị bằng IFNα và được thử nghiệm để tìm các kháng thể được chỉ định.IgG của chuột và thỏ được sử dụng làm đối chứng âm tính.(C) Số lượng tương đối (đầu vào) của các kháng nguyên khác nhau được mô tả bởi các immunoblots được thử nghiệm chống lại các kháng thể được chỉ định, β-actin được sử dụng làm chất kiểm soát tải.
Các đặc tính cấu trúc của một trong những mạng liên kết ngang có độ tin cậy cao do interferon gây ra, H2B-HLA-A-HMGA1, đã được nghiên cứu.Chúng tôi đã sử dụng mô hình động lực phân tử như một phương pháp thay thế để hiểu động lực hình thành của các protein liên quan đến phức hợp này (Hình 8).Suy luận từ dữ liệu CLMS cho thấy khả năng có sự phù hợp khác nhau của protein H2B, HLA-A và HMGA1.Do đó, các phức tiềm năng sau đây đã được mô hình hóa trong môi trường dung môi: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A và H2B-HLA-A-HMGA1.Màn hình ghép protein-protein ban đầu sử dụng gói MOE (Môi trường hoạt động phân tử; Tập đoàn máy tính hóa học Inc., Montreal, Quebec, Canada) đã đề xuất những sự phù hợp có thể khác nhau giữa các protein này (Hình 8).Hình dung phức hợp protein gắn kết cho thấy một số tương tác và sự phù hợp có thể có (Hình 5A, 8).Do đó, một dạng có thể có được thể hiện trên Hình 8A (với các liên kết chéo được gắn nhãn) và nó được đánh giá thêm bằng cách sử dụng đường dẫn mô hình MD.Ngoài ra, việc liên kết H2B hoặc HMGA1 với HLA-A làm nổi bật ái lực cao hơn của H2B đối với HLA-A (Hình 8).
Động lực hình dạng của các mạng có thể có giữa các phức hợp H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A và H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Bảng bên trái là bản đồ 2D (được tạo trong phần mềm SIM-XL) của các liên kết ngang nội phân tử (màu đỏ) và liên phân tử (màu xanh) (ngắt liên kết ngang được đặt thành 3,5).Ngoài ra, các gốc liên kết ngang được xác định sẽ được dán nhãn trên cấu trúc của protein H2B, HLA-A và HMGA1.Sự phù hợp liên quan của các protein này được trích xuất bằng cách sử dụng đường dẫn lắp ghép được triển khai trong gói MOE.Bảng phía dưới bên trái hiển thị các dạng phù hợp khác nhau có thể có của phức hợp H2B-HLA-A và HMGA1-HLA-A với các ái lực liên kết protein-protein khác nhau (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Độ lệch chuẩn (RMSD) của vị trí nguyên tử (không bao gồm nguyên tử hydro) cho từng cấu trúc protein.(C) Tương tác liên kết hydro-protein liên phân tử từ các phức hợp mô phỏng khác nhau xem xét các tương tác cụ thể có thời lượng ≥ 10 ns.Khoảng cách cắt của nhà tài trợ-chấp nhận liên kết h được đặt thành 3,5 Å và góc cắt của nhà tài trợ-chấp nhận H được đặt thành ≥ 160°–180°.(D) Các gốc được dán nhãn tạo thành tương tác protein-protein HLA-A với các đối tác tương ứng của chúng, kéo dài ≥ 20 ns, được chiết xuất từ ​​phức hợp HLA-A-H2B và HLA-A-HMGA1 giả.Cấu trúc protein đại diện cho cấu trúc trung bình 100 ns MDS.(E) Tương tác giữa các phức hợp HLA-A-H2B và HLA-A-HMGA1 so với các tương tác được theo dõi bằng mô phỏng H2B-HLA trên 100 ns dựa trên vị trí tương tác K hoặc S giữa hai peptide.Phức hợp /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Giá trị ngưỡng để đánh giá liên kết chéo được đặt thành 3.0 và các tương tác cụ thể từ MDS lấy ≥ 10 ns đã được tính đến.Cấu trúc protein được hiển thị bằng cách sử dụng các gói BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) và Môi trường vận hành phân tử (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).
Độ ổn định của các phân tử HLA-A theo thời gian (độ lệch chuẩn; RMSD hoặc độ lệch chuẩn; RMSF) chỉ ra rằng sự hiện diện của protein H2B hoặc HMGA1 trong phức hợp đã ổn định HLA-A (Hình 8B, Hình S5).Protein HMGA1 liên kết chặt chẽ với vị trí B2M của HLA-A, tạo ra sự ổn định của axit amin HLA-A trong phức hợp HLA-A-HMGA1 hoặc H2B-HLA-A-HMGA1 (Hình 8B, Hình S5).đặc biệt, các gốc HLA ~60-90 và ~180-210 được phát hiện là kém linh hoạt hơn khi có mặt H2B (Hình 8B).H2B và HMGA1 cho thấy khả năng liên kết tốt hơn với HLA-A trong phức hợp H2B-HLA-A-HMGA1 so với HLA-A chỉ liên kết với H2B hoặc HMGA1 (Hình 8C, D; Bảng S5).Dư lượng liên quan đến liên kết hydro (công suất chiếm chỗ cao theo mô hình MD ≥ 10 ns) trùng với các vị trí tương tác CLMS (dư lượng K hoặc S) trong phức hợp, cho thấy rằng các tương tác được CLMS xác định là rất đáng tin cậy.Độ tin cậy (Hình 8E ).Trong mô hình CLMS và MD, các gốc HLA-A có khoảng từ 190-210 đến khoảng 200-220 axit amin được phát hiện là có khả năng liên kết tương ứng với H2B và HMGA1 (Hình 8E).
Tương tác protein-protein hình thành mạng lưới cấu trúc động làm trung gian cho giao tiếp nội bào để đáp ứng với các kích thích nhất định.Bởi vì nhiều phương pháp tiếp cận proteomics phát hiện những thay đổi ở mức trạng thái ổn định tổng thể của protein, động lực tương tác protein-protein đòi hỏi các công cụ bổ sung để nắm bắt các giao diện liên kết và CLMS là một trong những công cụ như vậy.Hệ thống tín hiệu interferon là một mạng lưới cytokine cho phép các tế bào phản ứng với một loạt các tín hiệu bệnh lý nội tại và gây bệnh môi trường, đỉnh điểm là tạo ra các tập hợp con protein cảm ứng interferon.Chúng tôi đã áp dụng CLMS để xác định xem có thể xác định được các tương tác protein-protein mới giữa một nhóm protein do interferon gây ra hay không.Phân tích liên kết ngang protein toàn cầu trong mô hình tế bào Flo-1 đáp ứng interferon đã được sử dụng để thu giữ các phức hợp protein.Việc chiết xuất các peptide tryptic từ các tế bào không liên kết chéo và liên kết ngang cho phép đếm peptide, làm giàu con đường và phân bố chiều dài peptide với cường độ LFQ xác định.Các protein cảm ứng interferon chính tắc được xác định là một biện pháp kiểm soát nội bộ tích cực, trong khi các chất cộng liên kết ngang nội phân tử và nội phân tử mới của các protein cảm ứng interferon chính tắc như MX1, UP18, OAS3 và STAT1 đã được quan sát.Các đặc điểm cấu trúc và tương tác khác nhau trong các khu vực chức năng đã được nghiên cứu.
Sự tương tác giữa HLA-A, MDN1 và H2B đã được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch trong các tế bào Flo-1 và A549 được điều trị và không điều trị bằng IFNα.Kết quả của chúng tôi nhấn mạnh rằng phức hợp HLA-A với H2B theo cách phụ thuộc IFNα.Công việc của chúng tôi đại diện cho một con đường thú vị để khám phá sâu hơn về sự đồng địa hóa của hai khu phức hợp này.Cũng sẽ rất thú vị khi mở rộng phương pháp CLMS sang một nhóm các dòng tế bào để xác định các tương tác protein qua trung gian interferon độc lập với loại tế bào.Cuối cùng, chúng tôi đã sử dụng mô hình MD như một phương pháp thay thế để hiểu động lực hình thành của các protein liên quan đến phức hợp H2BFS-HLA-A-HMGA1, theo dõi các cuộc trao đổi chéo nội phân tử và giữa các phân tử.Suy luận từ dữ liệu CLMS cho thấy khả năng có sự phù hợp khác nhau của protein H2BFS, HLA-A và HMGA1.Sự phù hợp khác nhau có thể có giữa các phức hợp protein lắp ghép này cho thấy một số tương tác tương tự như những tương tác được quan sát trong bộ dữ liệu CLMS.Một trong những điểm mạnh chính của phương pháp của chúng tôi là nó cho phép dễ dàng xác định các gen tương tác có tính đa hình cao như HLA, do đó sẽ rất thú vị khi nghiên cứu sự tương tác của các protein đặc hiệu haplotype HLA mà khó nghiên cứu.Kết hợp lại với nhau, dữ liệu của chúng tôi chứng minh rằng CLMS có thể được sử dụng để mở rộng hiểu biết của chúng tôi về mạng tín hiệu do interferon gây ra và cung cấp cơ sở để nghiên cứu các hệ thống nội bào phức tạp hơn trong môi trường vi mô khối u.
Các tế bào Flo-1 được lấy từ ATCC và được duy trì trong DMEM (Gibco) bổ sung 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% huyết thanh bò bào thai (Gibco) và được bảo quản ở 37°C và 5% CO2.Ủ.Các tế bào đã được phát triển đến mức hợp lưu 70-80% trước khi được xử lý bằng IFNα14 (do Cơ sở sản xuất Protein Edinburgh sản xuất).Tất cả các hóa chất và thuốc thử khác được mua từ Sigma Aldrich trừ khi có ghi chú khác.
Các tế bào Flo-1 được nuôi cấy trong các đĩa 6 giếng và ngày hôm sau, các tế bào này được xử lý với 10 ng/ml IFNα14 trong 24 giờ để đạt độ hợp lưu khoảng 80%.Các tế bào được rửa ba lần bằng PBS và gắn DSS (Thermo Fisher Scientific) mới chuẩn bị (hòa tan trong DMSO) trong PBS trong 5 phút ở 37° C. đến nồng độ cuối cùng là 0,5 mM.Phản ứng liên kết ngang DSS được thay thế bằng PBS và DSS dư được loại bỏ bằng cách thêm 20 mM Tris (độ pH=8,0) vào PBS trong 15 phút ở 37°C.Các tế bào được thu thập bằng cách cạo và thu thập trong các ống có độ liên kết thấp (Axygen).
Các viên tế bào được ly giải với 300 µl dung dịch đệm ly giải urê (urê 8 M, Tris 0,1 M, pH 8,5) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, thỉnh thoảng lắc.Tất cả các bước ly tâm được thực hiện ở tốc độ 14.000 xg ở 8°C.Ly tâm dịch ly giải trong 10 phút và chuyển phần nổi phía trên sang ống mới.Các hạt trong suốt còn lại được hòa tan trong 150 μl dung dịch đệm ly giải thứ hai (2 M urê, 2% (w/v) SDS (natri dodecyl sulfate)) trong 30 phút trở lên cho đến khi thu được dung dịch nước đồng nhất.Lysate được ly tâm trong 20 phút và chất nổi phía trên được trộn với lysate thu được ở bước trước.Nồng độ protein được đánh giá bằng xét nghiệm Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất về quy trình vi đĩa.Các mẫu được đông lạnh nhanh chóng trong nitơ lỏng và bảo quản ở -80°C.
Khoảng 100 μg protein liên kết ngang hòa tan được xử lý bằng quy trình chuẩn bị mẫu lọc sửa đổi (FASP) như mô tả của Wisniewski et al.69 Tóm lại, protein được liên kết ngang với 200 µl đệm urê (8 M urê trong 0,1 M Tris, độ pH 8,5), được xoáy và giảm một nửa.Tất cả các bước ly tâm được thực hiện ở tốc độ 14.000 xg ở 25°C.Nửa đầu của lysate protein liên kết ngang được chuyển sang thiết bị lọc ly tâm 10 kDa Microcon được trang bị màng Ultracel-10 (Merck), sau đó ly tâm trên bộ lọc trong 25 phút.Sau đó thêm nửa protein còn lại vào bộ lọc và lặp lại các bước tương tự.Việc thu hồi protein được thực hiện bằng cách thêm 100 μl 17 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) vào đệm urê.Sự thu hồi được khuấy trên máy trộn nhiệt ở tốc độ 600 vòng/phút trong 30 phút ở 37°C.Ngoài ra, cột được ly tâm và protein liên kết ngang đã khử được kiềm hóa bằng cách sử dụng 100 μl iodoacetamide 50 mM trong đệm urê.Phản ứng alkyl hóa được thực hiện ở nhiệt độ phòng trong 20 phút trong bóng tối.Xoay cột, rửa thành cột 3 lần bằng 100 µl đệm urê, sau đó ly tâm.Hoạt động tương tự được thực hiện 3 lần bằng cách sử dụng 100 μl amoni bicarbonate 100 mM.Trước khi cố gắng thử, hãy thay ống thu bằng ống mới.Thêm dung dịch đệm tiêu hóa chứa 50 mM ammonium bicarbonate và 1 µl trypsin được pha loãng trong dung dịch đệm trypsin (Promega).Tỷ lệ trypsin so với protein được duy trì ở khoảng 1:33 và các phản ứng tiêu hóa được ủ qua đêm ở 37°C trong buồng ẩm.Peptide liên kết ngang được rửa giải khỏi bộ lọc bằng cách ly tâm trong 25 phút.Khả năng thu hồi peptide được cải thiện bằng cách thêm 50 μl NaCl 0,5 M vào bộ lọc, sau đó ly tâm trong 25 phút.
Cột Micro Spin C18 (Thiết bị Harvard) được sử dụng để khử muối các peptide tryptic liên kết ngang theo giao thức được mô tả bởi Bouchal et al.70 với những sửa đổi nhỏ.Tóm lại, cột spin C18 được kích hoạt bằng ba lần rửa axit formic (FA) 0,1% trong acetonitril (AcN) (Merck) và hai lần rửa 0,1% FA.Cột được ngậm nước bằng 0,1% FA trong 15 phút.Nạp mẫu vào cột quay và rửa 3 lần với FA 0,1%.Các peptide đã khử muối được rửa giải tuần tự theo gradient từng bước sử dụng 50%, 80% và 100% AcN trong 0,1% FA.Các mẫu được sấy khô trong máy cô đặc SpeedVac Plus (Eppendorf) cho đến khi chất lỏng còn sót lại biến mất hoàn toàn.Các peptide rửa giải được hòa tan trong 100 μl axit trifluoroacetic 0,08% trong 2,5% AcN và nồng độ được đo trên NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Khoảng 1 μg peptide liên kết ngang trên mỗi mẫu được tiêm vào hệ thống LC-MS/MS.
Các peptide liên kết ngang được phân tách trên hệ thống UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) được kết nối với máy quang phổ khối Orbitrap Exploris 480 (Thermo Scientific).Các peptit liên kết chéo được thu thập trên cột thu giữ C18 trước cột 300 µm, dài 5 mm được đóng gói bằng chất hấp thụ C18 PepMap100 và chất hấp thụ PepMap 5 µm (Thermo Scientific).Nạp bộ lưu lượng bơm ở mức 5 µl/phút axit trifluoroacetic 0,08% hòa tan trong 2,5% AcN.Các peptide liên kết ngang được phân tách trên cột silica nung chảy phân tích có đường kính trong 75 μm và chiều dài 150 mm, chứa đầy chất hấp thụ PepMap 2 μm (Thermo Scientific).Pha động A và B lần lượt bao gồm 0,1% FA trong nước và 0,1% FA trong acetonitril.Độ dốc bắt đầu ở 2,5% B và tăng tuyến tính lên 40% B trong 90 phút, sau đó lên 90% B trong 2 phút tiếp theo.Thành phần pha động được duy trì ở mức 90% B trong 10 phút và sau đó giảm tuyến tính xuống 2,5% B trong 2 phút.Cột được cân bằng ở mức 2,5% B trong 8 phút trước chu kỳ tiếp theo.Các peptide liên kết ngang được rửa giải từ cột phân tích được ion hóa trong nguồn ion hóa phun điện tử nano (NSI) và được bơm vào máy quang phổ khối Exploris 480 (Thermo Scientific).
Máy quang phổ khối Orbitrap Exploris 480 hoạt động ở chế độ tương quan dữ liệu dương.Quét toàn bộ được thực hiện ở chế độ từng phần ở độ phân giải 120.000 với cài đặt phạm vi từ m/z 350 Th đến m/z 2000 Th.Mục tiêu AGC chuẩn hóa được đặt ở mức 300% với thời gian đầu vào tối đa là 50 mili giây.Phát hiện đỉnh đơn đồng vị đã được thiết lập cho peptide.Tham số thư giãn ràng buộc được đặt thành true nếu tìm thấy quá ít tiền chất.Cường độ ion tối thiểu của tiền chất được đặt thành 5,0e3 và trạng thái điện tích tiền chất lên tới +8 được đưa vào các thí nghiệm.
Thời gian chu kỳ giữa các lần quét chính ở chế độ tương quan dữ liệu được đặt thành 2,5 giây.Loại trừ khối lượng động được đặt thành 20 giây sau lần phân mảnh đầu tiên của ion tiền chất.Cửa sổ cách ly tiền thân được đặt thành 2 Th.Loại năng lượng va chạm được chuẩn hóa với chế độ năng lượng va chạm cố định đã được chọn trong quá trình quét MS/MS phụ thuộc dữ liệu.Năng lượng va chạm được đặt ở mức 30%.Độ phân giải Orbitrap được đặt thành 15.000 và mục tiêu AGC là 100%.Thời gian tiêm tối đa tùy chỉnh được đặt thành 60 mili giây.
Trước khi theo dõi mạng lưới protein-protein trong các mẫu liên kết ngang, chúng tôi đã xử lý các tệp thô bằng gói MaxQuant (phiên bản 1.6.12.0)26,27 để xác định các peptide/protein có thể theo dõi trong các mẫu.Ngoài ra, các phân tích protein tương tự đã được thực hiện trên các mẫu Flo-1 không liên kết ngang được xử lý và không được xử lý bằng IFNα.Dữ liệu MS/MS được tìm kiếm trong cơ sở dữ liệu con người UniProt (www.uniprot.org) (được tải lên ngày 12 tháng 8 năm 2020, chứa 75.093 mục nhập) bằng công cụ tìm kiếm tích hợp Andromeda27.Việc tìm kiếm được thực hiện mà không chỉ ra tính đặc hiệu của enzyme và các biến đổi khác nhau của quá trình khử amit (N, Q) và quá trình oxy hóa (M).Dung sai khối lượng tiền chất được đặt ở mức 20 ppm và các ion sản phẩm ở mức 0,02 Da.Độ lệch khối lượng ban đầu và tối đa được đặt thành 10 ppm.Khối lượng tối đa của peptide được đặt ở mức 4600 Da và độ tương tự trình tự được đặt trong khoảng từ 7 đến 25 axit amin (aa).Phân tích thống kê sâu hơn được thực hiện bằng chương trình Perseus (phiên bản 1.6.10.45).Hàm lượng protein được tính bằng cách chuẩn hóa cường độ quang phổ của protein (cường độ LFQ; định lượng không nhãn)27 và các giá trị cường độ được chuyển đổi thành Log2.Một nhóm protein phân cấp được xác định theo cường độ peptide của chúng được xây dựng bằng cách sử dụng gói pheatmap (v1.0.12) trong R (v 4.1.2).Phân tích làm giàu con đường được thực hiện bằng cách sử dụng cơ sở dữ liệu con đường Reactome cho các protein được xử lý bằng IFNα được kích hoạt hơn bốn lần so với các mẫu chưa được xử lý.
Việc xác định các liên kết ngang hóa học đặc hiệu lysine (K) hoặc serine (S) của các phức hợp protein được LC-MS/MS theo dõi được thực hiện bằng máy nhận dạng quang phổ (SIM-XL) cho các peptide liên kết ngang (SIM-XL)29.Đầu tiên, các tương tác có thể có giữa các gen đặc trưng kháng tổn thương DNA (IRDS) liên quan đến interferon (IFN) đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng bộ dữ liệu protein IRDS được mô tả trong Padariya et al.28.Việc sàng lọc tất cả các điều kiện và số lần lặp lại của toàn bộ UniProt của con người đòi hỏi tính toán chuyên sâu, do đó, toàn bộ cơ sở dữ liệu UniProt của con người (www.uniprot.org) (được tải xuống vào ngày 12 tháng 8 năm 2020, chứa 75.093 mục nhập) đối với các lần lặp lại được xử lý bằng IFNα.Một trong những bộ lọc cho các tương tác có độ tin cậy cao.Những tương tác có ý nghĩa cao thu được này đã được mở rộng và thử nghiệm trong tất cả các lần lặp lại và điều kiện.
Trong SIM-XL, DSS được sử dụng cho liên kết chéo (XL) và độ dịch chuyển trọng số XL và độ dịch chuyển trọng số sửa đổi được đặt tương ứng là 138,06 và 156,07.Các vị trí phản ứng liên kết ngang sau đây được xem xét: KK, KS và KN-TERM, không có ion phóng viên.Cả tiền chất và đoạn ppm được đặt thành 20 và ngưỡng Xrea được đặt thành 0,15.Trypsin được coi là hoàn toàn đặc hiệu và phương pháp phân mảnh bẫy C (HCD) năng lượng cao đã được triển khai.Ngưỡng giảm DB động XCorr và số lượng peptide tối thiểu để giảm DB động lần lượt được đặt thành 2,5 và 2.Các thông số khác là: xác suất đồng vị đơn và điểm cắt trùng khớp cực đại, tối thiểu 4 dư lượng AA trên mỗi sợi và điện tích sợi tối đa, và 3 điểm phân tách bị bỏ sót tối đa.Các bản đồ 2D được khâu kết quả đã được phân tích trong (SIM-XL) và biểu diễn đồ họa xQuest28 được sử dụng để xây dựng bản đồ 2D.Liên kết ngang protein trên cấu trúc protein được cung cấp trong PyMol (Hệ thống đồ họa phân tử PyMOL, phiên bản 2.0 Schrödinger, LLC).
Các cấu trúc mô hình protein được tạo bằng máy chủ Phyre2 (//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 bằng cách sử dụng các nguyên tắc mô hình hóa tương đồng và triển khai “Phương pháp Markov ẩn”.Phyre2 tạo ra các cấu trúc mô hình dựa trên sự liên kết trình tự với các cấu trúc protein đã biết.Đối với các protein H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 và MDN1, cấu trúc mẫu 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 và 6i2665 đã được sử dụng.Ngoài ra, cấu trúc của AlphaFold71 MX1, UBP18 và ROBO1 cũng được xem xét.Cấu trúc protein được hiển thị bằng gói BIOVIA Discovery Studio Visualizer (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) và gói Môi trường vận hành phân tử (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).