Ống hàn song công ASTM A790 2507/2205 1.4462/1.4410 dành cho thành phần hóa học của ngành công nghiệp hóa chất, Sự thiếu hụt SPECC1L dẫn đến tăng độ ổn định của các khớp nối và giảm sự bong tróc của các tế bào mào thần kinh sọ.

Cảm ơn bạn đã ghé thăm Nature.com.Bạn đang sử dụng phiên bản trình duyệt có hỗ trợ CSS hạn chế.Để có trải nghiệm tốt nhất, chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng trình duyệt đã cập nhật (hoặc tắt Chế độ tương thích trong Internet Explorer).Ngoài ra, để đảm bảo được hỗ trợ liên tục, chúng tôi hiển thị trang web không có kiểu và JavaScript.

Ống hàn song công ASTM A790 2507/2205 1.4462 / 1.4410 cho ngành công nghiệp hóa chất

Công ty TNHH Vật liệu Liao Cheng Sihe SSlà nhà sản xuất hàng đầu chuyên về ống liền mạch bằng thép không gỉ, ống ủ sáng, ống cuộn liền mạch, v.v.Để tạo điều kiện thuận lợi cho khách hàng, chúng tôi còn có cả ống và ống hàn.Công ty TNHH Vật liệu Liao Cheng Sihe SScó thiết bị sản xuất và thử nghiệm tiên tiến nhất.Chúng tôi hoàn toàn có thể đáp ứng được yêu cầu của bạn.Theo tiêu chuẩn rất nghiêm ngặt, ống do chúng tôi sản xuất luôn có dung sai OD và WT chính xác.Việc kiểm soát dung sai được thực hiện theo đúng tiêu chuẩn sản xuất.Sản phẩm của chúng tôi luôn làm hài lòng khách hàng.Khách hàng mua sản phẩm của chúng tôi tạo ra nhiều lợi nhuận hơn.
a) OD (Đường kính ngoài): 3,18mm đến 101,6mm
b) WT (Độ dày của tường): 0,5mm đến 20 mm
c) Chiều dài: Theo yêu cầu của khách hàng
d) Tiêu chuẩn : ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790, v.v.
e) Phương pháp xử lý: ERW, EFW, v.v.

Thanh trượt hiển thị ba bài viết trên mỗi slide.Sử dụng các nút quay lại và tiếp theo để di chuyển qua các trang chiếu hoặc các nút điều khiển trang chiếu ở cuối để di chuyển qua từng trang chiếu.
Các tế bào mào thần kinh sọ não (CNCC) bong ra khỏi các nếp thần kinh của phôi thai và di chuyển đến các vòm họng, tạo thành hầu hết các cấu trúc giữa mặt.Rối loạn chức năng CNCC đóng một vai trò quan trọng trong nguyên nhân của hở hàm ếch, một dị tật bẩm sinh phổ biến.Đột biến dị hợp tử SPECC1L đã được tìm thấy ở những bệnh nhân bị sứt môi không điển hình và sứt môi hội chứng.Ở đây, chúng tôi báo cáo việc nhuộm màu tăng cường của các thành phần mối nối dính chính tắc (AJ), β-catenin và E-cadherin trong các tế bào phân hủy SPECC1L được nuôi cấy và ảnh chụp vi điện tử cho thấy sự khuếch tán đỉnh-cơ bản của AJ.Để hiểu vai trò của SPECC1L trong quá trình hình thành hình thái sọ mặt, chúng tôi đã tạo ra một mô hình chuột thiếu Specc1l.Các đột biến đồng hợp tử gây chết phôi và biểu hiện sự đóng ống thần kinh và khả năng ghép CNCC bị suy yếu.Nhuộm protein AJ được tăng lên ở các nếp gấp thần kinh đột biến.Khiếm khuyết AJ này phù hợp với khiếm khuyết trong quá trình phân tách CNCC, đòi hỏi phải giải thể AJ.Ngoài ra, các đột biến Specc11 đã làm giảm tín hiệu PI3K-AKT và tăng khả năng tự chết theo chương trình.Trong ống nghiệm, sự ức chế nhẹ tín hiệu PI3K-AKT trong các tế bào hoang dại là đủ để tạo ra những thay đổi AJ.Điều quan trọng là những thay đổi AJ gây ra bởi sự sụp đổ của SPECC1L có thể được đảo ngược bằng cách kích hoạt đường dẫn PI3K-AKT.Kết hợp lại với nhau, những dữ liệu này cho thấy rằng SPECC1L, với tư cách là bộ điều chỉnh mới về tín hiệu PI3K-AKT và sinh học AJ, là cần thiết để đóng ống thần kinh và phân tầng CNCC.
Các tế bào mào thần kinh sọ (CNCC) định vị ở ngoại bì thần kinh lưng và tách ra khỏi biểu mô thần kinh của các nếp thần kinh đang phát triển thông qua một quá trình liên quan đến quá trình chuyển tiếp biểu mô-trung mô (EMT)1,2,3.Các CNCC biểu mô di chuyển trước sẽ phá vỡ các mối nối giữa các tế bào và trở thành các CNCC trung mô di chuyển lấp đầy vòm họng thứ nhất và thứ hai và hình thành hầu hết sụn sọ mặt.Do đó, các gen điều chỉnh chức năng CNCC thường bị gián đoạn trong nguyên nhân của các dị tật bẩm sinh ở sọ mặt như sứt môi, thường ảnh hưởng nhất đến 1/800 ca sinh chỉ riêng ở Hoa Kỳ.Một trong những dị tật bẩm sinh8.
Sự tách lớp của CNCC trùng với thời điểm đóng ống thần kinh trước trong khoảng thời gian từ 8,5 đến 9,5 ngày phát triển phôi thai ở chuột.Đột biến của một số gen liên quan đến hở hàm ếch ở chuột cũng biểu hiện một số dạng khiếm khuyết ống thần kinh, bao gồm Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 và Pdgfrα12.Tuy nhiên, các quá trình đóng ống thần kinh và phân tầng CNCC có thể được coi là độc lập, vì chuột đột biến Splotch (Pax3) biểu hiện các khiếm khuyết trong việc đóng ống thần kinh mà không có bất kỳ ảnh hưởng nào đến sự phân tầng hoặc di chuyển CNCC13,14.Các mô hình chuột bổ sung có khiếm khuyết trong quá trình mổ xẻ CNCC và đóng ống thần kinh sẽ giúp phân định cơ sở phân tử chung của hai quá trình này.
Việc phân lập CNCC khỏi các tế bào biểu mô thần kinh đòi hỏi phải hòa tan các mối nối dính (AJ), bao gồm các phức hợp protein có chứa E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin và α-actinin liên kết với các sợi Actin. Các nghiên cứu biểu hiện quá mức E-cadherin ở các nếp gấp thần kinh cho thấy sự giảm hoặc chậm trễ trong quá trình phân tách CNCC.Ngược lại, việc ức chế E-cadherin dẫn đến sự phân tầng sớm15,16.Nhiều yếu tố làm trung gian cho EMT trong quá trình phân tầng CNCC là các yếu tố phiên mã (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) và các protein tái cấu trúc ma trận ngoại bào (ECM) như metallicoproteinase ma trận (MMP), tuy nhiên CNCC là các chất điều chỉnh AJ khung tế bào trực tiếp là vẫn chưa biết.Con đường PI3K-AKT được biết là có tác dụng đối kháng nồng độ E-cadherin, chủ yếu từ nghiên cứu về ung thư17.Các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng việc mất tín hiệu PI3K-AKT dựa trên PDGFα ở chuột dẫn đến các bất thường về sọ mặt, bao gồm hở hàm ếch và dị tật ống thần kinh12.Tuy nhiên, mối quan hệ giữa con đường PI3K-AKT và độ ổn định của AJ khi phân tầng CNCC là không rõ ràng.
Trước đây chúng tôi đã xác định SPECC1L là gen đột biến đầu tiên ở hai người bị sứt môi nghiêm trọng kéo dài từ miệng đến mắt, được gọi là sứt môi xiên (ObFC) hoặc sứt môi Tessier IV18.Các đột biến SPECC1L đã được xác định ở hai gia đình nhiều thế hệ mắc hội chứng Opitz G/BBB nhiễm sắc thể thường trội (OMIM #145410), trong đó các cá nhân bị ảnh hưởng có biểu hiện tăng khoảng cách và sứt môi/vòm miệng19, và trong một gia đình mắc hội chứng khoảng cách quá xa Tibi (OMIM #145420)20 .hơn một nửa số trường hợp mắc hội chứng Opitz G/BBB là liên kết với X (OMIM #300000) và gây ra bởi đột biến gen MID1, mã hóa protein 22 của bộ xương tế bào liên kết với vi ống.Chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng SPECC1L, cũng là một protein liên kết với các vi ống và khung tế bào Actin, có thể làm trung gian truyền tín hiệu cần thiết cho quá trình tái cấu trúc khung tế bào Actin trong quá trình bám dính và di chuyển tế bào 18 .Thông qua các nghiên cứu in vitro và in vivo, giờ đây chúng tôi mô tả SPECC1L như một chất điều chỉnh mới về độ ổn định của AJ thông qua tín hiệu PI3K-AKT.Ở cấp độ tế bào, sự thiếu hụt SPECC1L dẫn đến giảm mức độ protein pan-AKT và tăng sự phân tán đỉnh-cơ bản của AJ, điều này đã được loại bỏ bằng cách kích hoạt hóa học của con đường AKT.In vivo, phôi thiếu Specc11 cho thấy khả năng đóng ống thần kinh bị suy giảm và giảm khả năng bóc tách CNCC.Do đó, SPECC1L hoạt động trong việc truyền tín hiệu dựa trên độ bám dính tế bào được điều chỉnh cao cần thiết cho chức năng CNCC bình thường trong quá trình hình thành khuôn mặt.
Để mô tả vai trò của SPECC1L ở cấp độ tế bào, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào ung thư xương ổn định U2OS được mô tả trước đó thiếu SPECC1L18.Các tế bào U2OS ổn định này bị phân hủy SPECC1L (kd) có mức giảm vừa phải (60–70%) về mức độ phiên mã và protein của SPECC1L, cùng với các khiếm khuyết trong việc di chuyển và tái tổ chức bộ xương tế bào Actin 18. Ngược lại, sự giảm thoáng qua nghiêm trọng về SPECC1L đã được chứng minh là gây ra khiếm khuyết về phân bào 23 .Sau khi mô tả thêm đặc điểm, chúng tôi nhận thấy rằng các tế bào SPECC1L-kd ổn định của chúng tôi đã thay đổi hình thái ở mức độ hợp lưu rất cao (Hình 1).Các ô điều khiển riêng lẻ và các ô kd ở mức hợp lưu thấp trông giống nhau (Hình 1A, D).24 giờ sau khi hợp nhất, các ô điều khiển vẫn giữ được hình dạng hình khối (Hình 1B, E), trong khi các ô SPECC1L-kd kéo dài ra (Hình 1C, F).Mức độ thay đổi về hình dạng tế bào này được ghi lại bằng hình ảnh trực tiếp in vivo của các tế bào đối chứng và tế bào kd (phim 1).Để xác định vai trò của SPECC1L trong các ô hợp lưu, trước tiên chúng tôi đã kiểm tra biểu hiện của nó.Chúng tôi thấy rằng mức protein SPECC1L tăng lên khi phản ứng tổng hợp (Hình 1G), trong khi mức độ phiên mã SPECC1L không tăng (Hình 1H).Ngoài ra, khi mật độ tế bào tăng lên, protein SPECC1L tích lũy ở ranh giới giữa các tế bào (Hình 2A-E), với kiểu mẫu chồng chéo với kiểu mẫu β-catenin liên kết với màng (Hình 2A'-E').Dựa trên sự liên kết của SPECC1L với bộ khung tế bào Actin 18,23, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng SPECC1L tương tác với các mối nối dính dựa trên Actin (AJ).
(AF) Các tế bào phân hủy SPECC1L (DF) kéo dài ở mức hợp lưu cao (F) so với các tế bào U2OS kiểm soát (AC).Dưới đây là ba trong số sáu điểm thời gian (T1, T3, T6) mà chúng tôi đã chọn cho các mật độ ô khác nhau.(G) Phân tích Western blot cho thấy protein SPECC1L được ổn định ở mức độ hợp lưu cao so với mức độ hợp lưu thấp trong các tế bào đối chứng.Western blot của SPECC1L cho thấy dải 120 kDa dự kiến ​​và dải trọng lượng phân tử cao hơn, có thể được sửa đổi sau dịch mã (*).Phân tích Western blot được thực hiện trong cùng điều kiện cho độ hợp lưu thấp và cao.Các hình ảnh hiển thị SPECC1L ở mức hợp lưu thấp và cao được lấy từ cùng một ô.Vết mờ tương tự đã được loại bỏ và kiểm tra lại bằng kháng thể β-actin.(H) Phân tích RT-PCR định lượng cho thấy không có thay đổi đáng kể nào về mức độ phiên mã SPECC1L.Thanh lỗi đại diện cho SEM từ bốn thí nghiệm độc lập.
(AE) Chúng tôi đã chọn sáu điểm thời gian (T1-T6) đại diện cho một phạm vi mật độ ô để bình thường hóa phân tích hình dạng ô và các thay đổi AJ trong các ô U2OS khi phân tích SPECC1L (kd).Năm thời điểm đầu tiên trong số này bao gồm các ô đơn (T1), sự kết hợp 50-70% của các cụm tế bào nhỏ (T2), sự kết hợp mà không định hình lại các ô kd (T3), định hình lại các ô kd (T4) và thay đổi 24 giờ.ở dạng sau của tế bào kd (T5).Protein SPECC1L chủ yếu được phân tán trong tế bào chất ở T1 (A), nhưng sự tích lũy của nó được quan sát thấy ở ranh giới giữa các tế bào tại các thời điểm tiếp theo (B–E, mũi tên).(FJ) β-catenin cho thấy sự tích lũy tương tự ở ranh giới giữa các tế bào liên quan đến phức hợp AJ.(A'-E') SPECC1L và β-catenin cho thấy sự nhuộm màu chồng chéo ở viền tế bào ở mật độ tế bào cao (mũi tên).(F'-J') Trong các tế bào SPECC1L-kd, nhuộm β-catenin xuất hiện bình thường ở mật độ tế bào thấp (F'-H'), nhưng mở rộng khi hình dạng tế bào thay đổi (I', J'; mũi tên), chỉ ra rằng AJ đã thay đổi.Thanh = 10 µm.
Sau đó, chúng tôi đã cố gắng xác định ảnh hưởng của tình trạng thiếu SPECC1L đối với AJ.Chúng tôi đã sử dụng một số dấu hiệu liên quan đến AJ, bao gồm các thành phần chính tắc F-actin, myosin IIb,-catenin và E-cadherin24,25,26,27.Sợi Actin căng thẳng tăng lên trong các tế bào SPECC1L-kd như được mô tả trước đây (Hình 3A, B) 18 .Myosin IIb liên kết với các sợi Actin cho thấy sự gia tăng tương tự các tế bào SPECC1L-kd trong ống nghiệm (Hình 3C, D).β-catenin liên kết với AJ liên kết với cadherin ở màng tế bào, hiển thị kiểu biểu hiện “tổ ong” bình thường trong các tế bào hình khối kiểm soát (Hình 3E, G).Điều thú vị là, trong các hình ảnh phẳng sử dụng kính hiển vi đồng tiêu, nhuộm β-catenin (Hình 3E, F) và E-cadherin (Hình 3G, H) trên màng tế bào của các tế bào thiếu SPECC1L hợp lưu cho thấy các kiểu nhuộm màu kéo dài nổi bật.Sự mở rộng nhuộm β-catenin liên quan đến AJ trong các tế bào kd này rõ rệt nhất ở nơi hợp lưu, nhưng dường như xảy ra trước những thay đổi về hình dạng tế bào (Hình 2F-J, F'-J').Để xác định bản chất vật lý của quá trình nhuộm AJ mở rộng này, chúng tôi đã kiểm tra các đường viền tế bào trên bề mặt đáy-đỉnh của các tế bào SPECC1L-kd U2OS bằng kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) (Hình 3I, J).Ngược lại với các ô điều khiển (Hình 3I), có các vùng đậm đặc electron riêng biệt biểu thị AJ (mũi tên), các ô kd (Hình 3J) cho thấy các vùng lớn, liền kề có mật độ electron cao biểu thị AJ dọc theo mặt phẳng apicobasal..Ngoài ra, trên các mặt cắt ngang, chúng tôi đã quan sát thấy các nếp gấp màng tế bào rộng rãi trong các tế bào kd (Hình S1A, B), điều này giải thích mô hình mở rộng của các dải nhuộm β-catenin và E-cadherin (Hình 3F, H).Để hỗ trợ vai trò của SPECC1L trong AJ,-catenin đã được đồng kích thích miễn dịch với SPECC1L trong các tế bào U2OS hợp lưu (Hình 3K).Cùng với khả năng duy trì miễn dịch mở rộng cho các dấu hiệu AJ, phân tích TEM phù hợp với giả thuyết của chúng tôi rằng sự thiếu hụt SPECC1L làm tăng mật độ và phương sai đỉnh-cơ bản AJ.
(AH) Tăng nhuộm F-actin trong tế bào kd sau 48 giờ sau phản ứng tổng hợp (T6; A, B).Sự nhuộm màu của myosin IIb bị thay đổi liên quan đến F-actin (C, D).Kiểu nhuộm màng β-catenin và E-cadherin mượt mà trong các tế bào đối chứng (E, G) đã được tăng cường trong các tế bào SPECC1L-kd (F, H).Thanh = 10 µm.(I–J) Ảnh vi điện tử quan sát mối nối giữa tế bào đỉnh-cơ bản.Các ô điều khiển hiển thị các vùng đậm đặc electron riêng biệt biểu thị các mối nối dính (I, mũi tên).Ngược lại, toàn bộ mối nối đỉnh-cơ bản trong các tế bào SPECC1L-kd xuất hiện mật độ electron dày đặc (J, mũi tên), cho thấy mật độ và sự phân tán của các mối nối dính tăng lên.(K) β-catenin được đồng kích thích miễn dịch với SPECC1L trong dung dịch ly giải tế bào U2OS hợp lưu.Hình ảnh được chụp từ một vị trí đại diện cho một trong bốn thí nghiệm độc lập.
Để hiểu được vai trò của SPECC1L trong quá trình hình thành hình thái sọ mặt, chúng tôi đã tạo ra một mô hình chuột thiếu Specc1l bằng cách sử dụng hai dòng tế bào bẫy ES độc lập là DTM096 và RRH048 (BayGenomics, CA), đại diện cho các bản phiên mã intron 1 và Specc1l được ghi lại ở mức 15 ( Hình 1) .4A, hình S2).Vị trí bộ gen của vectơ chèn mồi nhử được xác định bằng toàn bộ trình tự bộ gen và được xác nhận bằng PCR (Hình S2).Cả hai thiết kế bẫy gen cũng cho phép phản ứng tổng hợp trong khung của các phóng viên Specc11-lacZ khi chụp.Do đó, biểu hiện lacZ được xác định bằng nhuộm X-gal được sử dụng làm chỉ báo biểu hiện Specc11.Cả hai alen đều thể hiện các kiểu biểu hiện lacZ tương tự nhau, với bẫy gen DTM096 ở intron 1 cho thấy biểu hiện mạnh hơn RRH048 ở intron 15 (không được hiển thị).Tuy nhiên, Specc1l được thể hiện rộng rãi, với biểu hiện đặc biệt mạnh mẽ ở các nếp gấp thần kinh ở E8.5 (Hình 4B), trong ống thần kinh và các quá trình trên khuôn mặt ở E9.5 và E10.5 (Hình 4C, D) và trong việc phát triển các chi tại E10.5 và mắt (Hình 4D).Trước đây chúng tôi đã báo cáo rằng biểu hiện SPECC1L ở vòm họng đầu tiên ở E10.5 hiện diện trong biểu mô và trung mô bên dưới18, phù hợp với dòng CNCC.Để kiểm tra biểu hiện SPECC1L trong CNCC, chúng tôi đã thực hiện các nếp gấp thần kinh E8.5 (Hình 4E-J) và các phần hộp sọ E9.5 (Hình 4K-).Tại E8.5, các nếp gấp thần kinh được nhuộm màu mạnh mẽ (Hình 4E, H), bao gồm các tế bào được nhuộm bằng dấu NCC (Hình 4G, J).Tại E9.5, SPECC1L (Hình 4K, N) CNCC di chuyển được nhuộm màu mạnh mẽ cùng với AP2A (Hình 4L, M) hoặc SOX10 (Hình 4O, P).
(A) Trình bày sơ đồ gen Specc11 của chuột cho thấy việc chèn vectơ mồi nhử trong các dòng vô tính tế bào ES DTM096 (intron 1) và RRH048 (intron 15).(BD) nhuộm lacZ của phôi Specc1lDTM096 dị hợp tử biểu thị biểu hiện Specc1l từ E8.5 đến E10.5.NE = ngoại bì thần kinh, NF = nếp thần kinh, PA1 = vòm họng thứ nhất.(EP) Tăng cường miễn dịch SPECC1L bằng các dấu NCC AP2A và SOX10 ở các nếp gấp thần kinh E8.5 (NF; EJ) và các phần hộp sọ E9.5 (KP).Nhuộm SPECC1L được quan sát rộng rãi ở các nếp gấp thần kinh E8.5 (E, H; đầu mũi tên), bao gồm các tế bào được dán nhãn AP2A (F, G; đầu mũi tên) và SOX10 (I, J; đầu mũi tên).Tại E9.5, SPECC1L nhuộm màu mạnh các CNCC di chuyển (K, N; mũi tên) được gắn nhãn AP2A (L, M; mũi tên) và SOX10 (O, P; mũi tên).
Việc lai giữa chuột dị hợp tử Specc1lDTM096/+ và Specc1lRRH048/+ cho thấy hai alen bẫy gen không bổ sung cho nhau và các dị hợp tử và đồng hợp tử phôi đối với một trong hai alen bẫy gen đều gây chết phôi (Bảng S1).Tỷ lệ Mendel cho thấy tỷ lệ sống sót của người dị hợp tử khi sinh giảm (dự kiến ​​là 1,34 so với 2,0).Chúng tôi ghi nhận tỷ lệ tử vong chu sinh thấp ở những người dị hợp tử, một số có dị tật sọ mặt (Hình S3).Tuy nhiên, mức độ xâm nhập thấp của các kiểu hình sọ mặt chu sinh này gây khó khăn cho việc nghiên cứu các cơ chế sinh lý bệnh cơ bản của chúng.Do đó, chúng tôi tập trung vào kiểu hình gây chết phôi của các đột biến Specc11 đồng hợp tử.
Hầu hết các phôi đột biến dị hợp tử hoặc đồng hợp tử Specc1lDTM096/RRH048 không phát triển sau E9.5–10.5 (Hình 5A–D) và ống thần kinh không đóng về phía trước (Hình 5B, D) và đôi khi đóng về phía sau (không hiển thị) ..Khiếm khuyết đóng ống thần kinh sọ não này có liên quan đến phần lớn DLX2 được đánh dấu CNCC còn lại trong các nếp gấp thần kinh ở E10.5, cho thấy không có sự bóc tách (Hình 5A'-D').Để xác định xem kích thước tổng thể của CNCC có bị giảm hay không, chúng tôi đã gắn thẻ các dòng CNCC với GFP trong các dòng bẫy gen của chúng tôi bằng Wnt1-Cre và ROSAmTmG.Chúng tôi truyền trực tuyến GFP + NCC và GFP- (RFP +) không phải NCC được sắp xếp từ toàn bộ phôi.Tại E9.5, tỷ lệ CNCC được gắn nhãn GFP được sắp xếp theo dòng không thay đổi đáng kể giữa phôi WT và phôi đột biến (không hiển thị), biểu thị thông số CNCC bình thường.Do đó, chúng tôi đã đưa ra giả thuyết rằng vết nhuộm Wnt1-Cre và DLX2 còn sót lại ở các nếp gấp thần kinh lộ ra (Hình 5B') là do lớp CNCC bị khiếm khuyết, có thể do mật độ hoặc sự phân tán của các tế bào AJ tăng lên, như đã thấy trong các tế bào SPECC1L-kd.Chúng tôi đã sử dụng các điểm đánh dấu NCC SOX10, AP2A và DLX2 để xác nhận sự hiện diện của CNCC trong nếp gấp thần kinh (Hình 5E-R).Tại E8.5, nhuộm nếp gấp thần kinh cho cả ba điểm NCC đã được quan sát thấy trong các phần của WT (Hình 5E, G, I) và đột biến Specc1l (Hình 5F, H, J).Tại E9.5, trong khi các điểm đánh dấu NCC nhuộm màu NCC di chuyển trong các phần WT (Hình 5M, O, Q), vết NCC còn sót lại được quan sát thấy ở các nếp gấp thần kinh lộ ra của phôi đột biến Specc1l (Hình 5N, P, R).Do SOX10 và DLX2 đánh dấu các CNCC di chuyển, kết quả này cho thấy các CNCC thiếu SPECC1L đạt được thông số kỹ thuật sau di chuyển nhưng không thể di chuyển từ các nếp gấp thần kinh.
Sự thiếu hụt Specc11 dẫn đến khiếm khuyết trong việc đóng ống thần kinh, tách các tế bào mào thần kinh sọ và AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Phôi mang tế bào mào thần kinh sọ di chuyển (CNCC) được dán nhãn Wnt1-Cre (A').Ngược lại, phôi đột biến Specc11 cho thấy các nếp gấp thần kinh mở (B), đầu mũi tên) và CNCC chưa di chuyển (B', đầu mũi tên).(C, D') Hình ảnh trường sáng (C, D') và khả năng miễn dịch (C', D') của điểm đánh dấu CNCC DLX2 của phôi E10.5 WT (C, C') và Specc1l (D, D').Trong phôi WT E10.5, CNCC dương tính với DLX2 xâm chiếm các vòm mang (C', mũi tên), trong khi ở các thể đột biến, vết nhuộm dễ thấy vẫn tồn tại ở các nếp gấp thần kinh mở (D', mũi tên) và trong vòm họng thứ nhất (D', mũi tên).) với một số vết màu (mũi tên) cho thấy khả năng phân tách và di chuyển kém của CNCC.ER) Các phần của phôi đột biến WT và Specc1l ở giai đoạn E8.5 (E–L) và E9.5 (M–R) được dán nhãn bằng các dấu NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) và DLX2 (I, J, Q, R).Tại E8.5, nhuộm NCC được quan sát thấy ở các phần nếp gấp thần kinh kiểu hoang dã (NF) và các phần đột biến.Nhuộm đồng thời SOX10 và β-catenin trong E8.5 WT (K) và đột biến (L) cho thấy nhuộm β-catenin tăng lên ở ranh giới tế bào trong các nếp gấp thần kinh.Tại E9.5, người ta đã quan sát thấy sự nhuộm màu hoang dã của các CNCC di chuyển (M, O, Q), trong khi ở các đột biến, các CNCC không phân tầng nhuộm màu các nếp gấp thần kinh mở (N, P, R).(S–Z) Phân tích ghi nhãn AJ in vivo trong các phần vành của phôi WT và Specc11DTM096/RRH048 có đột biến E9.5.Một mặt cắt gần đúng được hiển thị ở góc trên bên phải.Trong các phần của mô đột biến, người ta quan sát thấy sự nhuộm màu của F-actin (S, T) và myosin IIb (U, V) tăng lên.Tương tự như kết quả in vitro ở Hình 3, ở phôi đột biến, người ta đã quan sát thấy nhuộm màng tăng cường β-catenin (W, X) và E-cadherin (Y, Z).(AA-BB) Ảnh hiển vi điện tử của một phần phôi kiểu hoang dã nhìn ra ngoài ranh giới của tế bào đáy-đỉnh cho thấy một vùng đậm đặc electron riêng biệt biểu thị các mối nối dính (AA, mũi tên).Ngược lại, trong các phần của phôi đột biến Specc11 (BB, mũi tên), toàn bộ mối nối apicobasal có mật độ electron dày đặc, cho thấy mật độ và sự phân tán của các mối nối dính tăng lên.
Để kiểm tra giả thuyết của chúng tôi rằng việc phân lớp giảm là do AJ bị thay đổi, chúng tôi đã kiểm tra việc ghi nhãn AJ ở các nếp gấp thần kinh lộ ra của phôi đột biến Specc1l (Hình 5S-Z).Chúng tôi đã quan sát thấy sự gia tăng của các sợi gây căng thẳng Actin (Hình 5S, T) và sự gia tăng đồng thời của việc nhuộm myosin IIB trên các sợi Actin (Hình 5U, V).Điều quan trọng là chúng tôi quan sát thấy sự nhuộm màu β-catenin (Hình 5W, X) và E-cadherin (Hình 5Y, Z) tăng lên ở các ranh giới giữa các tế bào.Chúng tôi cũng kiểm tra nhuộm β-catenin của NCC trong các nếp gấp thần kinh của phôi E8.5 (Hình 5K, L).Nhuộm β-catenin dường như mạnh hơn ở các nếp gấp thần kinh đột biến Specc1l (Hình 5L và K), cho thấy những thay đổi AJ đã bắt đầu.Trong ảnh chụp vi điện tử của các phần hộp sọ của phôi E9.5, một lần nữa chúng tôi quan sát thấy sự nhuộm màu đậm đặc electron khuếch tán tăng lên trong phôi đột biến Specc1l so với WT (Hình 5AA, BB và S1E-H).Kết hợp lại với nhau, những kết quả này hỗ trợ kết quả in vitro của chúng tôi trong các tế bào U2OS SPECC1L-kd và cho thấy rằng nhuộm AJ sai lệch xảy ra trước sự phân tầng CNCC trong phôi đột biến của chúng tôi.
Do mối quan hệ đối kháng đã biết giữa hoạt động AKT và độ ổn định của E-cadherin,17,28 chúng tôi đã đưa ra giả thuyết về sự liên quan của tín hiệu PI3K-AKT.Ngoài ra, chúng tôi đã quan sát thấy hiện tượng phồng rộp dưới biểu bì ở một số phôi đột biến của chúng tôi đã thoát khỏi trạng thái gây chết (<5%) ở E9.5-10.5 và thay vào đó ổn định ở khoảng E13.5 (Hình S3).Các túi dưới biểu bì là dấu hiệu đặc trưng của việc giảm tín hiệu PI3K-AKT dựa trên PDGFRα12.Fantauzzo và cộng sự.(2014) đã báo cáo rằng sự gián đoạn hoạt hóa PI3K dựa trên PDGFRα trong phôi đột biến PdgfraPI3K/PI3K dẫn đến các túi dưới biểu bì, khuyết tật ống thần kinh và kiểu hình hở hàm ếch.Thật vậy, mức độ pan-AKT và Ser473-AKT được phosphoryl hóa hoạt động đã giảm in vivo trong các mô đột biến Specc1l thành hiện tượng bắt giữ phôi E9.5 (Hình 6A-D).Sự giảm mức độ phosphoryl hóa Ser473-AKT có thể hoàn toàn là do sự giảm mức độ pan-AKT in vivo (Hình 6E) và trong ống nghiệm (Hình 6F).Sự giảm trong ống nghiệm chỉ được quan sát thấy khi các tế bào U2OS kết hợp chặt chẽ với những thay đổi về hình dạng tế bào và mật độ AJ (Hình 6D).Do đó, dữ liệu của chúng tôi cho thấy SPECC1L là một chất điều chỉnh tích cực mới đối với tín hiệu PI3K-AKT trong quá trình hình thành hình thái sọ mặt.
(A–E) Các phần hộp sọ E8.5 (A, B) và E9.5 (C, D) hoặc ly giải E9.5 từ phôi đột biến Specc1l (E) cho thấy mức độ giảm protein S473-AKT và pan-AKT bị phosphoryl hóa hoạt động , so với đối chứng WT.Phương pháp làm mờ phương Tây đã được thực hiện trên các loại lysate hoang dã và các lysates đột biến trong cùng điều kiện.Các hình ảnh hiển thị cho SPECC1L được chụp từ một đốm.Vết mờ tương tự đã được loại bỏ và kiểm tra lại bằng kháng thể kháng pan-ACT và β-actin.Mức Pan-AKT trong các nếp gấp thần kinh E8.5 (A, B) và mức độ phosphoryl hóa S473-AKT trong các phần hộp sọ E9.5 đã giảm đáng kể.( F ) Mức Pan-AKT cũng giảm tương tự trong các dung dịch ly giải của các tế bào U2OS SPECC1L-kd được thu hoạch ở mức hợp lưu cao.Các thanh lỗi biểu thị SEM từ ba định lượng blot độc lập của phương Tây.(GJ) Các phần của phôi WT ở E9.5 được nhuộm bằng KI67 và caspase 3 được phân tách tương ứng, cho thấy sự tăng sinh tế bào (G, G ') và ít hoạt động apoptotic (H, H').Phôi đột biến Specc11 cho thấy sự tăng sinh tế bào tương đương (I), nhưng số lượng tế bào trải qua quá trình apoptosis tăng lên đáng kể (J).
Sau đó chúng tôi đã kiểm tra các dấu hiệu của sự tăng sinh và quá trình chết theo chương trình.Chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ sự khác biệt nào về sự tăng sinh của phôi E9.5 (Hình 6E, G so với I) với chỉ số tăng sinh là 82,5% đối với đột biến WT và 86,5% đối với đột biến Specc1l được đo bằng nhuộm KI67 (p <0,56, Fisher's kiểm tra chính xác).Tương tự, chúng tôi không quan sát thấy bất kỳ sự khác biệt nào về quá trình apoptosis được đo bằng cách nhuộm caspase 3 bị cắt ở các nếp gấp thần kinh ở E8.5 cho đến khi bắt giữ phôi (không hiển thị) (không hiển thị).Ngược lại, apoptosis tăng đáng kể ở tất cả các phôi đột biến E9.5 (Hình 6F, H và J).Sự gia tăng tổng thể về apoptosis này phù hợp với việc giảm tín hiệu PI3K-AKT và khả năng gây chết phôi sớm29,30,31.
Tiếp theo, để xác nhận vai trò nguyên nhân đối với tín hiệu PI3K-AKT trong những thay đổi AJ trong các tế bào kd của chúng tôi, chúng tôi đã thay đổi về mặt hóa học con đường trong các tế bào điều khiển và kd (Hình 7A-F).Chúng tôi đã sử dụng làm điểm đánh dấu kiểu hình thay đổi hình dạng ô được quan sát thấy trong các ô SPECC1L-kd hợp lưu, chúng tôi đã định lượng bằng tỷ lệ giữa kích thước dài nhất (chiều dài) với kích thước dọc (chiều rộng) tương ứng.Tỷ lệ 1 được mong đợi đối với các ô tương đối tròn hoặc hình khối (Hình 7G).Ngoài hình dạng tế bào, chúng tôi cũng xác nhận tác động lên AJ bằng cách nhuộm β-catenin (Hình 7A'-F').Việc ức chế con đường PI3K-AKT bằng wortmannin là đủ để thay đổi hình dạng tế bào trong các tế bào đối chứng (Hình 7A, C) và AJ (Hình 7A').Bộ kích hoạt PI3K-AKT SC-79 không ảnh hưởng đến hình dạng ô (Hình 7A, E) hoặc sự mở rộng AJ (Hình 7A') trong ô điều khiển.Trong các tế bào SPECC1L-kd, việc ngăn chặn thêm con đường PI3K-AKT dẫn đến tăng apoptosis (Hình 7B, D) và tăng rõ rệt nhuộm β-catenin (Hình 7B '), phù hợp với các đột biến nặng in vivo của chúng tôi.Điều quan trọng là việc kích hoạt con đường PI3K-AKT đã cải thiện đáng kể hình dạng tế bào (Hình 7B, F) và kiểu hình AJ (Hình 7B”).Những thay đổi về hình dạng tế bào được định lượng bằng tỷ lệ độ tròn của tế bào (CCR) và được so sánh về mức độ quan trọng như được mô tả ở trên (Hình 7G).Thật vậy, trong các tế bào đối chứng (Hình 7G, CCR = 1,56), việc xử lý bằng wortmannin đủ để làm thay đổi đáng kể hình dạng tế bào (Hình 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) ở mức tương tự như mức được quan sát trong SPECC1L.-kd ô (Hình 7G, CCR = 3,46).Việc xử lý bằng Wortmannin đối với các tế bào SPECC1L-kd (Hình 7G, CCR = 3,60, không đáng kể) không đáng kể hơn so với các tế bào kd chưa được xử lý (Hình 7G, CCR = 3,46, không đáng kể) hoặc các tế bào đối chứng được xử lý bằng wortmannin (Hình 7G)., CCR = 3,46, không đáng kể) còn ảnh hưởng đến độ giãn dài của tế bào (7G, CCR = 3,61, không đáng kể).Quan trọng nhất, bộ kích hoạt SC-79 AKT đã khôi phục kiểu hình kéo dài của các tế bào SPECC1L-kd (Hình 7G, CCR = 1,74, p < 6,2 × 10-12).Những kết quả này xác nhận rằng SPECC1L điều chỉnh tín hiệu PI3K-AKT và cho thấy rằng SPECC1L giảm vừa phải ảnh hưởng đến độ bám dính của tế bào, trong khi mức giảm mạnh dẫn đến apoptosis (Hình 8).
(A–F') Các tế bào đối chứng (A, C, E) và SPECC1L-kd (B, D, F) được xử lý bằng chất ức chế con đường PI3K-AKT wortmannin (C, D) hoặc chất kích hoạt SC-79 (E, F) Điều trị .Các tế bào đối chứng không được xử lý có dạng hình khối (A) với màu tế bào β-cat bình thường (A'), trong khi các tế bào kd có hình thon dài (B) với màu nhuộm β-cat tăng lên (B').Sau khi ngăn chặn con đường PI3K-AKT, các tế bào điều khiển kéo dài (C) với sự mở rộng β-cat (C'), trong khi các tế bào kd bắt đầu trải qua quá trình apoptosis (D), tương tự như phôi bị đột biến cao của chúng tôi và cho thấy β-cat cực kỳ tăng cường.nhuộm màu (D').Sau khi kích hoạt con đường PI3K-AKT, các tế bào đối chứng vẫn có hình khối (E) và nhuộm β-cat (E') bình thường, trong khi các tế bào kd cho thấy hình dạng tế bào (F) và nhuộm β-cat (F') được cải thiện đáng kể, cho thấy (G) Mức độ thay đổi hình dạng ô trong (AF) được định lượng bằng cách sử dụng tỷ lệ độ tròn của ô (CCR) của kích thước dài nhất (chiều dài) và kích thước dọc (chiều rộng) tương ứng bằng phần mềm MetaMorph.Các ô SPECC1L-kd không được xử lý (NT) (CCR = 3,46) dài hơn đáng kể so với các ô đối chứng (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Sự ức chế con đường PI3K-AKT của Wort trong các tế bào đối chứng là đủ để gây ra sự kéo dài tương tự về hình dạng tế bào (CCR=3,61, p<2,4×10-9).Tương tự, kích hoạt AKT bằng SC-79 trong các ô SPECC1L-kd đã khôi phục độ giãn dài của ô về mức kiểm soát (CCR = 1,74, p < 6,2 × 10–12).Việc xử lý bằng Wortmannin đối với các tế bào SPECC1L-kd dẫn đến tăng apoptosis nhưng không làm tăng thêm sự thay đổi hình dạng tế bào (CCR=3,60) so với kd không được điều trị (CCR=3,46, ns) hoặc các tế bào đối chứng được xử lý bằng wortmannin (3,61) được quan sát thấy ở .ns = không quan trọng.Các phép đo +/- SEM cho 50 ô được hiển thị.Sự khác biệt thống kê được tính toán bằng cách sử dụng bài kiểm tra t của Sinh viên.
( A ) Trình bày sơ đồ ức chế và kích hoạt con đường PI3K-AKT dẫn đến thay đổi và giải cứu AJ tương ứng.(B) Mô hình đề xuất để ổn định protein AKT bằng SPECC1L.
CNCC tiền di cư yêu cầu ly giải AJ để tách khỏi các tế bào biểu mô thần kinh nếp gấp thần kinh phía trước1,15,32.Sự nhuộm màu của các thành phần AJ tăng lên và mất sự phân bố không đối xứng AJ cơ bản ở đỉnh trong các tế bào thiếu SPECC1L cả in vitro và in vivo, kết hợp với sự gần gũi về mặt vật lý của SPECC1L với β-catenin, cho thấy rằng SPECC1L hoạt động để duy trì ổn định cục bộ AJ một cách hợp lý cho cơ tổ chức.khung tế bào Actin.Sự kết hợp của SPECC1L với khung tế bào Actin và β-catenin và sự gia tăng số lượng sợi Actin ngưng tụ khi không có SPECC1L phù hợp với sự gia tăng mật độ AJ được quan sát thấy.Một khả năng khác là số lượng sợi Actin tăng lên trong các tế bào thiếu SPECC1L dẫn đến thay đổi sức căng giữa các tế bào.Vì căng thẳng tế bào ảnh hưởng đến động lực học của AJ 33 nên sự thay đổi điện áp có thể dẫn đến AJ 34 khuếch tán nhiều hơn.Vì vậy mọi thay đổi sẽ ảnh hưởng đến các lớp CNCC.
Wnt1 được biểu hiện ở các nếp gấp thần kinh sớm tạo ra các tế bào mào thần kinh.Do đó, việc theo dõi dòng dõi Wnt1-cre đánh dấu cả NCC35 trước và di chuyển.Tuy nhiên, Wnt1 cũng đánh dấu các dòng vô tính mô não lưng cũng có nguồn gốc từ các nếp gấp thần kinh sớm 35,36, khiến cho việc nhuộm các đột biến E9.5 của chúng tôi để tìm dấu hiệu Wnt1 trong các nếp gấp thần kinh mở không phải là CNCC.Việc nhuộm màu dương tính của chúng tôi đối với các dấu NCC AP2A và SOX10 đã xác nhận rằng các nếp gấp thần kinh lộ ra của phôi đột biến Specc11 thực sự có chứa CNCC.Ngoài ra, vì AP2A và SOX10 là các dấu hiệu của NCC di chuyển sớm, nên việc nhuộm màu dương tính cho thấy các tế bào này là CNCC sau di chuyển và không thể phân tầng theo E9.5.
Dữ liệu của chúng tôi cho thấy rằng sự điều hòa phân tử AJ của SPECC1L được điều hòa bởi tín hiệu PI3K-AKT.Tín hiệu AKT bị giảm ở các tế bào và mô thiếu SPECC1L.Những phát hiện của Fantauzzo et al.hỗ trợ vai trò trực tiếp cho tín hiệu PI3K-AKT trong hình thái sọ mặt.(2014) đã chỉ ra rằng việc thiếu kích hoạt tín hiệu PI3K-AKT dựa trên PDGFRα dẫn đến kiểu hình hở hàm ếch.Chúng tôi cũng chỉ ra rằng việc ức chế con đường PI3K-AKT là đủ để thay đổi AJ và hình dạng tế bào trong các tế bào U2OS.Phù hợp với những phát hiện của chúng tôi, Cain et al.37 cho thấy rằng sự điều hòa giảm tiểu đơn vị PI3K α110 trong tế bào nội mô dẫn đến sự gia tăng tương tự trong nhuộm β-catenin quanh tế bào, được gọi là sự gia tăng “chỉ số kết nối”.Tuy nhiên, trong các tế bào nội mô có các sợi Actin đã được tổ chức chặt chẽ, việc ức chế con đường PI3K-AKT dẫn đến hình dạng tế bào lỏng lẻo.Ngược lại, các tế bào SPECC1L-kd U2OS cho thấy hình dạng tế bào thon dài.Sự khác biệt này có thể là loại tế bào cụ thể.Trong khi việc ức chế tín hiệu PI3K-AKT ảnh hưởng vĩnh viễn đến khung tế bào Actin, thì ảnh hưởng đến hình dạng tế bào được xác định bởi sự thay đổi độ căng do thay đổi mật độ và tổ chức của các sợi Actin trung tâm.Trong các ô U2OS, chúng tôi chỉ sử dụng các thay đổi về hình dạng ô làm điểm đánh dấu sự thay đổi và phục hồi AJ thiếu SPECC1L.Để kết luận, chúng tôi đưa ra giả thuyết rằng việc ức chế con đường AKT khi thiếu SPECC1L làm tăng độ ổn định của AJ và giảm sự phân tách trong CNCC.
Điều thú vị là, mức độ pan-AKT đã giảm trong ống nghiệm và in vivo bên cạnh mức độ phosphoryl hóa 473-AKT khi không có SPECC1L, cho thấy sự điều chỉnh tín hiệu PI3K-AKT ở mức độ ổn định hoặc luân chuyển protein AKT.Các gen SPECC1L và MID1, cả hai đều liên quan đến hội chứng Opitz/GBBB, mã hóa các protein giúp ổn định vi ống 18,22.Cơ chế ổn định vi ống trung gian SPECC1L và MID1 vẫn chưa được hiểu đầy đủ.Trong trường hợp của SPECC1L, sự ổn định này bao gồm quá trình acetyl hóa tăng cường của một tập hợp con vi ống 18.Có thể SPECC1L sử dụng cơ chế tương tự để ổn định các protein khác như AKT.Người ta đã chứng minh rằng quá trình acetyl hóa dư lượng lysine trong protein AKT dẫn đến giảm quá trình định vị màng và giảm phosphoryl hóa38.Ngoài ra, cần phải phổ biến chuỗi K63 ở cùng dư lượng lysine trên AKT để định vị và kích hoạt màng của nó39,40.Trong số một số yếu tố tương tác với protein SPECC1L được xác định trong các màn hình lai hai loại men thông lượng cao khác nhau, bốn yếu tố - CCDC841, ECM2942, APC và UBE2I43 - có liên quan đến sự luân chuyển hoặc tính ổn định của protein thông qua quá trình phổ biến hoặc tổng hợp.SpecC1L có thể tham gia vào quá trình biến đổi hậu dịch mã của dư lượng lysine AKT, ảnh hưởng đến độ ổn định của AKT.Tuy nhiên, vai trò quan trọng của SPECC1L trong việc định vị và ổn định protein AKT vẫn chưa được làm rõ.
Những khiếm khuyết nghiêm trọng trong biểu hiện SPECC1L trên cơ thể dẫn đến tăng sự nhuộm màu của điểm đánh dấu AJ và lớp phủ CNCC bị khiếm khuyết, cũng như tăng khả năng chết theo chương trình và làm chết phôi sớm.Các báo cáo trước đây đã chỉ ra rằng các đột biến ở chuột có mức độ apoptosis tăng lên có liên quan đến các khuyết tật ống thần kinh 44,45,46,47 và các khuyết tật sọ mặt48.Có ý kiến ​​cho rằng sự chết tế bào quá mức ở các nếp gấp thần kinh hoặc vòm họng có thể dẫn đến không đủ số lượng tế bào cần thiết cho sự di chuyển hình thái thích hợp48,49,50.Ngược lại, các dòng tế bào thiếu hụt SPECC1L của chúng tôi với biểu hiện SPECC1L giảm vừa phải chỉ cho thấy những thay đổi AJ mà không có bằng chứng về sự chết tế bào gia tăng.Tuy nhiên, sự ức chế hóa học của con đường PI3K-AKT trong các tế bào Kd này đã dẫn đến tăng apoptosis.Do đó, việc giảm vừa phải biểu hiện hoặc chức năng của SPECC1L đảm bảo sự sống sót của tế bào.Điều này phù hợp với quan sát cho thấy phôi đột biến Specc11 hiếm gặp thoát khỏi sự bắt giữ ở st.E9.5—có lẽ do hiệu quả bắt giữ gen giảm—có thể đóng các ống thần kinh của chúng và dừng quá trình phát triển sau này, thường có các khiếm khuyết về sọ mặt (Hình S3).Cũng phù hợp với điều này là sự xuất hiện hiếm hoi của phôi Specc1l dị hợp tử với các bất thường về sọ mặt—có thể là do hiệu quả bắt giữ gen tăng lên—cũng như phát hiện ở cá ngựa vằn trong đó một trong hai chỉnh hình SPECC1L (specc1lb) gây ra các kiểu hình phôi muộn, bao gồm mất hàm dưới và sứt môi hai bên51.Do đó, các đột biến mất chức năng SPECC1L dị hợp tử được xác định ở bệnh nhân người có thể gây ra những suy giảm nhỏ về chức năng SPECC1L trong quá trình hình thành hình thái sọ mặt, đủ để giải thích các vết nứt ở miệng của họ.Sự điều hòa các tiếp xúc giữa các tế bào dựa trên SPECC1L cũng có thể đóng một vai trò trong quá trình hình thành khẩu vị và sự hợp nhất của vòm họng.Các nghiên cứu sâu hơn về chức năng SPECC1L sẽ giúp làm sáng tỏ vai trò của các tiếp xúc giữa các tế bào tạm thời trong CNCC trong quá trình đóng ống thần kinh đối với sự vận động của tế bào biểu mô thần kinh và hình thái sọ mặt.
Kiểm soát ung thư xương U2OS và các tế bào SPECC1L-kd đã được mô tả trước đây (Saadi và cộng sự, 2011).Các kháng thể chống lại SPECC1L cũng đã được mô tả trước đây (Saadi và cộng sự, 2011).Kháng thể kháng β-catenin (thỏ; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (chuột; 1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biology, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA ), KI67 (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA), caspase 3 đã tách (1:1000; Công nghệ tín hiệu tế bào, Danvers, MA) và β-actin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) đã được sử dụng như mô tả..Các sợi Actin được nhuộm bằng Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Các tế bào kiểm soát U2OS và tế bào SPECC1L-kd được nuôi cấy trong DMEM glucose cao tiêu chuẩn bổ sung 10% huyết thanh bò bào thai (Life Technologies, Carlsbad, CA).Đối với những thay đổi AJ, 2 x 105 tế bào được gieo vào thủy tinh được xử lý bằng gelatin lợn 0,1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) và quan sát những thay đổi về hình dạng tế bào.Các tế bào được thu thập tại các thời điểm được chỉ định khác nhau: 4 giờ sau khi gieo hạt (t = 1), 24 giờ sau khi gieo hạt (t = 2), hợp lưu mà không thay đổi hình dạng tế bào (t = 3), thay đổi hình dạng tế bào (t = 4) , 24 giờ sau khi thay đổi hình dạng tế bào (t = 5) và 48 giờ sau khi thay đổi hình dạng tế bào (t = 6) (Hình 1, 2, 3).Để điều chỉnh con đường PI3K-AKT, các tế bào được nuôi cấy ở nồng độ được chỉ định với chất ức chế PI3K-AKT wortmannin (TOCRIS Bioscatics, Minneapolis, Minnesota) hoặc chất kích hoạt SC-79 (TOCRIS Bioscatics, Minneapolis Adams, Minnesota).Môi trường chứa hóa chất được thay đổi hàng ngày.
Việc ghi từng khung hình được thực hiện trên các tế bào điều khiển trực tiếp và tế bào KD trong điều kiện nuôi cấy bình thường và hình ảnh tương phản pha được thu thập 10 phút một lần trong 7 ngày.Hình ảnh được thu được bằng kính hiển vi đảo ngược Leica DM IRB điều khiển bằng máy tính được trang bị bệ cơ học và vật kính 10 × N-PLAN được kết nối với máy ảnh QImaging Retiga-SRV.Trong quá trình chụp ảnh, nuôi cấy tế bào được duy trì ở 37°C trong môi trường ẩm với 5% CO2.
Hai dòng tế bào ES bẫy gen DTM096 và RRH048 từ Trung tâm tài nguyên chuột đột biến khu vực (UC Davis, CA) đã được sử dụng để tạo ra các dòng chuột thiếu Specc11, được chỉ định là Specc1lgtDTM096 và Specc1lgtRRH046.Tóm lại, tế bào 129/REJ ES đã được tiêm vào phôi nang C57BL6.Kết quả là chuột đực khảm được lai với chuột cái C57BL6 để xác định con cái có màu lông agouti.Sự hiện diện của các vector bẫy gen được sử dụng để xác định các dị hợp tử.Chuột được nuôi trên nền hỗn hợp 129/REJ;C57BL6.Vị trí vị trí chèn của vectơ bẫy di truyền đã được xác nhận bằng RT-PCR, giải trình tự bộ gen và bổ sung di truyền (Hình bổ sung 1).Để theo dõi dòng CNCC của chuột Specc1lGT dị hợp tử kép, chuột ROSAmTmG (# 007576) và Wnt1-Cre (# 003829) (Phòng thí nghiệm Jackson, Bar Harbor, ME) đã được lai để tạo ra alen ROSAmTmG và Wnt1-Cre trong phôi đột biến Specc1l.Tất cả các thí nghiệm trên chuột được thực hiện theo các quy trình đã được phê duyệt bởi Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật Thể chế của Trung tâm Y tế Đại học Kansas.
Phôi được cố định trong (1% formaldehyde, 0,2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0,02% NP-40, 5 mM EGTA) trong 60 phút ở nhiệt độ phòng.Sau khi cố định trong dung dịch nhuộm X-gal (5 mM kali ferricyanide, 5 mM kali ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0,01% natri deoxycholate, 0,02% NP-40, 1 mg/ml X-gal) Quá trình nhuộm màu được thực hiện ở 37°C .°C trong vòng 1-6 giờ.Phôi được cố định sau trong 4% PFA và được hiển thị.
Đối với vết rạn da phương Tây, các tế bào được lọc trong dung dịch đệm ly giải thụ động (Promega, Fitchburg, WI) được bổ sung hỗn hợp các chất ức chế protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysate được xử lý trên gel làm sẵn 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, Hercules, CA) và được chuyển sang màng PVDF Immobileon (EMD Millipore, Billerica, MA).Màng này bị chặn trong sữa 5% trong PBS chứa 0,1% Tween.Các kháng thể được ủ qua đêm ở 4°C hoặc trong một giờ ở nhiệt độ phòng.Thuốc thử Femto SuperSignal West ECL (Thermo Scientific, Waltham, MA) đã được sử dụng để tạo tín hiệu.Để duy trì miễn dịch, phôi được cố định qua đêm trong 4% PFA/PBS và được bảo quản lạnh.Phương pháp đông lạnh mô được chặn trong PBS chứa 1% huyết thanh dê bình thường (Thermo Scientific, Waltham, MA) và 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) và sau đó được ủ ở 4°C trong tủ ấm trong thời gian đêm.với kháng thể và kháng thể thứ cấp huỳnh quang (1:1000) trong 1 giờ ở 4°C.Các phần nhuộm màu được đặt trong môi trường vàng ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) và thu được hình ảnh phẳng bằng kính hiển vi đồng tiêu Leica TCS SPE.Mỗi phương pháp miễn dịch được thực hiện dưới dạng ba thí nghiệm độc lập trên các phương pháp cắt ngang của ít nhất hai phôi đột biến.Một thí nghiệm đại diện được hiển thị.
Các tế bào được ủ trong dung dịch đệm RIPA đã được sửa đổi (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA và chất ức chế protease HALT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Tóm lại, lysate được tinh chế trước bằng các hạt từ tính protein G (Life Technologies, Carlsbad, CA) và sau đó được ủ qua đêm ở 4° C. với các hạt protein G kháng SPECC1L hoặc IgG được sử dụng để chiết xuất SPECC1L và phương pháp làm mờ vết rạn da phương Tây được thực hiện bằng cách sử dụng kháng thể kháng SPECC1L hoặc IgG. Kháng thể -β-catenin được mô tả ở trên Các thí nghiệm co-IP được hiển thị là đại diện của bốn thí nghiệm độc lập.
Các tế bào nuôi cấy cố định hoặc mô phôi chuột đã được cung cấp cho trung tâm kính hiển vi điện tử tại Trung tâm Y tế Đại học Kansas.Tóm lại, các mẫu được nhúng vào nhựa EMbed 812 (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polyme hóa qua đêm ở 60°C và được cắt ở bước sóng 80 nm bằng máy siêu vi mô Leica UC7 được trang bị lưỡi kim cương.Các phần được hiển thị bằng kính hiển vi điện tử truyền qua JEOL JEM-1400 được trang bị súng Lab6 100 kV.
Cách trích dẫn bài viết này: Wilson, NR et al.Sự thiếu hụt SPECC1L dẫn đến tăng độ ổn định của các khớp nối và giảm sự phân tách của các tế bào mào thần kinh sọ.khoa học.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Cảm ứng và biệt hóa của mào thần kinh.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR và ​​cộng sự.Các tế bào mào thần kinh sọ đang chuyển động: vai trò của chúng trong sự phát triển sọ mặt.Tạp chí Di truyền Y học Hoa Kỳ.Phần A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristoppathia: sự tăng trưởng và phát triển của nó trong hơn 20 năm.Bác sĩ nhi khoa.bệnh lý.phòng thí nghiệm.thuốc.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU và Noten MM Đột phá về di truyền của khe hở hàm mặt.Xu hướng trong Y học Phân tử 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. và Riley, FM Cơ chế phân tử của sự di chuyển và tạo khuôn của tế bào mào thần kinh sọ trong quá trình phát triển sọ mặt.Phát triển 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH và Murray, JK Sứt môi và vòm miệng: hiểu ảnh hưởng của di truyền và môi trường.nhận xét tự nhiên.Di truyền học 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR và cộng sự.Hình thái bất thường của da, tay chân và vùng sọ mặt ở chuột thiếu hụt yếu tố điều hòa interferon-6 (Irf6).Quốc gia Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. và cộng sự.Đột biến trội ở GRHL3 gây ra hội chứng van der Waord và làm suy giảm sự phát triển của vùng quanh miệng.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ và Juriloff, DM Cập nhật danh sách các chuột đột biến có khiếm khuyết trong việc đóng ống thần kinh và tiến tới hiểu biết di truyền hoàn chỉnh về việc đóng ống thần kinh.Điều tra dị tật bẩm sinh.Phần A, Sinh lý học lâm sàng và phân tử 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Tín hiệu PDGFRalpha qua trung gian Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K điều chỉnh sự sống sót và tăng sinh trong quá trình phát triển của xương thông qua con đường nội bào phụ thuộc p53.Phát triển gen 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND và Murdoch, JN Disheveled: Mối liên hệ giữa sự giãn nở hội tụ với việc đóng ống thần kinh.Xu hướng trong thần kinh học.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).